基于抗性指数的家蚕对核型多角体病抗性评价研究

蓝雅华 赵新华 何恩洁 栾 芳 陈勃生 于 婷梁喜丽 谢 森 邵勇奇 鲁兴萌

(1浙江大学蚕蜂研究所，浙江杭州 310058； 2浙江省桐乡市蚕业有限公司，浙江桐乡 314500；3浙江省蚕种质量检验检疫站，浙江杭州 310000)

养蚕业是我国的传统经典产业，也是少数在世界上具有产业规模优势的农业产业之一。家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclear polyhedrosis virus，BmNPV)引起的家蚕核型多角体病毒病(俗称血液型脓病或水白肚)是家蚕的主要病害，目前主要通过防止病毒或多角体的污染和清洁消毒等技术进行防控。品种是农业技术的重要基础，选育和推广使用具有良好抗性及经济性状的蚕品种，是解决养蚕中家蚕核型多角体病毒病流行最为高效的途径，也是近期各育种单位十分关注的领域。

抗病性主要由品种的遗传基础决定。有研究表明，家蚕对BmNPV病的抵抗性受多因子影响，经口感染的抵抗性遗传规律是受1对主效显性基因和若干微效基因控制，有偏父遗传性，杂交一代的抗病性表现出杂种优势，并存在超显性现象等抗性遗传规律[1-4]。家蚕对BmNPV病的抗性除受遗传基础的影响外，还受蚕体发育阶段[5]、饲育温湿度[6]、桑叶营养状况[7]、BmNPV来源[8]等因素的影响。其抗性的表现可采用死亡率[9]、发病率[10-11]、半数致死浓度(LC50)[12]、半数发病浓度(IC50)[10-11，13]、半数致死剂量(LD50)[14]等指标进行评价，其中死亡率与LC50[15-18]的应用较其他评判指标更为广泛。

在抗性育种过程中，采用LC50的方法[19-20]评价家蚕抗性是常用的方法，但在新品种的推广中如何评价不同品种的抗性，以及根据蚕区饲养条件选择合适的抗性蚕品种，采用LC50或与参照品种的差异，可能受饲养条件、桑叶质量和病毒活力等因素的影响而产生偏差，从而导致评价困难。为此，我们通过测定多批次蚕品种对BmNPV多角体的LC50，构建了一种基于抗性指数的蚕品种对BmNPV病抗性评价方法，该方法具有较好的可比性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试BmNPV 由浙江大学蚕蜂研究所家蚕病理学与病害控制实验室(以下简称浙大实验室)、苏州大学农业生物技术与生态研究院农业生物技术研究所(以下简称苏大实验室)和浙江省农业科学院蚕桑研究所保存和繁殖。苏大实验室提供数据的试验由苏大实验室实施，其它试验都在浙大实验室完成。

1.1.2 供试蚕品种 由相应的蚕品种选育单位提供，作为参照蚕品种的菁松×皓月、皓月×菁松、秋丰×白玉和白玉×秋丰由浙江省蚕种质量检验检疫站提供。供试蚕品种或杂交组合的名称，因考虑知识产权等原因而采用字母与数字表示，字母代表杂交组合，数字的单数代表正交，双数代表反交(表1)。采用常规方法催青、收蚁、饲养至1龄眠，随机挑选2龄起蚕，供试验用。

表1 不同实验室不同期别BmNPV抗性测定的供试蚕品种

浙大实验室为浙江大学蚕蜂研究所家蚕病理学与病害控制实验室的简称，苏大实验室为苏州大学农业生物技术与生态研究院农业生物技术研究所的简称；“/”代表数据缺失；不同的英文字母代表不同的蚕品种，其后的数字单数表示正交，双数表示反交；2018年夏①表示2018年夏第1次试验，2018年夏②表示2018年夏第2次试验；菁松×皓月后面的小写英文字母(a、b)表示该品种蚕种的不同生产单位。表2-4相同。

1.2 试验方法

本研究是在前期研究的基础上，根据参考文献[21]的方法(Reed-Muench法)进行LC50的测定。以2龄起蚕作为攻毒对象，设置4个10倍稀释浓度病毒多角体悬浮液，每个浓度设3个重复区，每个重复区30头蚕，同时设置无菌生理盐水添食作空白对照区。分别于2017年夏季、2017年秋季和2018年夏季进行了4次LC50的测定，其中2018年夏季进行了2次LC50的测定，分别用“2018年夏①”和“2018年夏②”表示(表1)。试验用攻毒BmNPV母液多角体浓度分别为1.30×109个/mL、1.00×109个/mL、1.05×109个/mL和1.74×108个/mL。

此外，苏大实验室提供了1批家蚕核型多角体病毒病LC50测定数据，其试验用攻毒BmNPV母液多角体浓度为1.00×109个/mL，其中参照品种菁松×皓月正反交为来自2个不同蚕种生产单位，分别用a和b表示(表1)。

1.3 数据统计分析

本研究采用Excel进行数据汇总统计，用SPSS 20.0软件计算LC50[22]。

2 结果与分析

2.1 参照蚕品种BmNPV多角体的LC50

菁松×皓月和秋丰×白玉是江浙蚕区农村饲养量较大的家蚕品种，也是家蚕新品种饲养和抗性比较试验中常用的参照蚕品种。浙大实验室和苏大实验室，分别在不同时期，用相同或类似的试验方法，测定了上述2对参照蚕品种正反交对BmNPV多角体的LC50(表2)。

表2 参照蚕品种BmNPV多角体的半数致死浓度(LC50) 个/mL

从表2可以看出，同一参照蚕品种在不同试验期别，或在不同实验室测定的BmNPV多角体的LC50存在一定差异，菁松×皓月、皓月×菁松、秋丰×白玉和白玉×秋丰的BmNPV多角体的LC50值最大差数分别为66.60、1.75、9.71和10.48倍。不同蚕种生产单位生产的相同蚕品种，同一实验室的同期试验蚕品种的LC50也有一定的差异，菁松×皓月和皓月×菁松的LC50值差数分别为1.14和1.51倍(苏大实验室)。

2.2 待测蚕品种BmNPV多角体的LC50

浙大实验室和苏大实验室，分别对50个(次)蚕品种(包括供试，相同或不同蚕品种，或不同杂交组合及正反交)进行了LC50的测定。从表3可以看出，不同待测蚕品种的LC50存在明显差异，最高的蚕品种的LC50值为1015.16(浙大实验室，2017年夏的L蚕品种)，最低的蚕品种的LC50值仅为105.79(浙大实验室，2017年夏的D1蚕品种)。待测蚕品种LC50值差异幅度最大出现在待测蚕品种最多的一次试验(浙大实验室，2017年夏)，为0～2.3×109倍之间。从表3还可以看出，同一待测蚕品种在相同实验室不同试验时期，以及相同实验室同一次试验中的LC50都会出现不同，但不同试验时期的差异较大，如浙大实验室2017年秋和2018年夏①的P2蚕品种的LC50值相差10.75倍；同一次试验的差异相对较小，如苏大实验室2017年夏的cC1相差0.17倍、cC2相差0.20倍、dD1相差0.26倍、dD2相差0.10倍。

表3 待测蚕品种BmNPV多角体的LC50

浙大实验室于2018年夏①测定的蚕品种P1因试验攻毒BmNPV悬浮液的多角体浓度不足以产生2个死亡率数据，无法得出LC50值。

2.3 不同蚕品种对BmNPV病的抗性评价

不同待测蚕品种Reed-Muench法测定的LC50不同，体现了不同蚕品种对BmNPV病的抗性差异，但LC50值为多少是属于抗性蚕品种或敏感蚕品种？不同LC50值适用于哪些蚕区？育种单位虽然可以通过LC50值比较抗性的改变，但不同实验期别LC50值的偏差造成的困惑如何解决？等等问题，都会在育种选拔效果评价或新品种推广选择中遭遇。上述不同实验室、不同试验时期和不同蚕品种对BmNPV多角体的LC50测定数据中，尽管试验方法较为一致，但还是出现同一蚕品种LC50的较大差异，证实了该类问题的存在。

为此，利用表3中相同蚕品种不同期别或同期试验结果，分别以1对或2对参照蚕品种的正反交LC50值为分母得出一个相对值(待测蚕品种LC50值/参照蚕品种正反交LC50值的平均数)作为BmNPV病抗性指数(表4)。待测蚕品种P2，在同一实验室的2次LC50测定数据分别为1010.55和109.48(差11倍)；在仅以菁松×皓月正反交为参照的情况下，BmNPV病抗性指数为22.80；在仅以秋丰×白玉正反交为参照的情况下，BmNPV病抗性指数为2.56。参照蚕品种的不同，同样出现对具体待测蚕品种抗性评价的较大差异，采用2对参照蚕品种正反交的4个LC50值平均数为分母，其BmNPV病抗性指数则为11.31，即增加参照蚕品种数量可以提高校正作用。cC1、cC2、dD1和dD2蚕品种为同一实验室的同期测定数据，本身其差异较小，按照上述BmNPV病抗性指数的方法比较其差异则更小。

表4 不同试验时期或同期不同试验组的BmNPV病抗性指数

因此，可以认为在以菁松×皓月和秋丰×白玉为主推蚕品种的江浙等蚕区，以其为参照蚕品种，同步测定待测蚕品种的LC50，并以BmNPV病抗性指数为蚕品种对BmNPV病抗性评价参数，较之单一的LC50具有更好的可比性。

3 讨论

随着家蚕核型多角体病毒病抗性特征在家蚕育种和新品种推广中的重要性日趋明显，家蚕品种对家蚕核型多角体病毒病抗性的评价逐渐被关注。LC50作为抗性测定的一种经典方法而被广泛应用，但由于蚕品种自身(群体遗传特征和繁育制种)、病毒以及桑叶等的不确定因素的存在[23-25]，尽管对试验条件作出较为严格的规范要求[21]，但依然不可避免LC50值在同一实验室的不同测定时期或不同实验室间出现较大的偏差或波动(表2和表3)，由此给抗性评价工作造成一定的困难。因此，采用BmNPV病抗性指数法(待测蚕品种LC50值/参照蚕品种正反交LC50值的平均数)[21]可有效减少上述困难，并为生产推广提供更为直观的评价结果。

在方法学方面，增加参照品种的数量将有利于待测品种抗性评价的稳定性，但过多的参照品种不仅增加LC50测定的工作量，也可能因参照品种来源的复杂性而产生其他方面的不确定因素。因此，参照品种和数量的确定，应该根据育种目标和推广区域的情况来确定。此外，近年来出现了部分对家蚕核型多角体病毒病具有很强抗性的蚕品种，在LC50测定中难以测到半数致死试验区的实际数据，一般采用相对较低多角体浓度攻毒试验区的死亡数据进行推测而来。因此，必须设置尽可能高的BmNPV多角体浓度和新鲜度，避免出现单一攻毒多角体浓度的死亡数据而无法进行LC50推测的情况。

家蚕品种对家蚕核型多角体病毒病抗性虽然受主效显性基因和若干微效基因控制[1-4]，但是家蚕品种群体内的抗性差异还是比较大的，或者说若干微效基因的作用也是不可小觑的因素。在LC50测定中，死亡与存活家蚕个体同时存在于一个攻毒多角体浓度梯度的试验区，且在3个攻毒多角体浓度梯度试验区出现的情况是常见的现象。分析该现象，可以认为测定家蚕品种对BmNPV多角体LC50的试验方法无法确定是否是由单一家蚕个体食下病毒量的不同或食桑等环境因子引起，但在1 000倍多角体浓度梯度设计情况下的差异，与遗传基础具有相关性的可能性是较高的。因此，家蚕抵抗病原微生物的抗性品种育成中，如何提高品种群体的抗性水平也是一个值得关注的问题。