HPLC测定不同套种模式下雷公藤不同部位甲素含量

李云鸽 乔一娜 张力 陈礼光 何天友 倪乐 郑郁善

摘要 [目的]以厚樸/雷公藤（处理①）、杉木/雷公藤（处理②）、马尾松/雷公藤（处理③）为3种套种模式，雷公藤纯林为CK对照组，建立不同套种模式下雷公藤甲素的HPLC测定方法，并对不同套种模式下雷公藤不同部位甲素的含量进行比较。[方法]采用高效液相色谱法（HPLC），色谱柱为SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇-水（体积比45∶55）;流速1.0 mL/min;检测波长218 nm;柱温40 ℃;进样量20 μL。[结果]该方法能在8 min左右实现雷公藤甲素的快速分离，雷公藤甲素浓度在1.55～248.00 μg/mL与峰面积线性关系良好（R2=0.999 7），平均加样回收率为99.6%，RSD为1.85%（n=6）。[结论]该方法易操作、分析速度快、重现性好、准确率高，可作为雷公藤甲素含量的测定方法。不同套种模式下雷公藤甲素总含量从高到低依次为处理①、CK、处理②、处理③，雷公藤不同部位的雷公藤甲素含量从高到低依次为根、叶、茎，说明厚朴林下套种雷公藤的模式可提高雷公藤甲素的含量，因此可作为优质林药间作模式广泛推广。

关键词 套种;雷公藤甲素;含量测定;高效液相色谱法

中图分类号 R 284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0219-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.063

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Triptolide in Different Parts of Tripterygium wilfordii in Different Interplanting Patterns by HPLC

LI Yun ge1， QIAO Yi na2， ZHANG Li1 et al

（1.College of Landscape Architecture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002; 2.College of Forestry， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract [Objective] There were three interplanting patterns of Magnolia officinalis/ Tripterygium wilfordii （Treatment 1）， Cunninghamia lanceolata/ Tripterygium wilfordii （Treatment 2）， Pinus massoniana/ Tripterygium wilfordii （Treatment 3）， and the pure forest of Tripterygium wilfordii was CK control group. HPLC method for the determination of triptolide in different interplanting patterns was established， and compared triptolide content in different parts of Tripterygium wilfordii. [Method]High performance liquid chromatography method was used， a SinoChrom ODS BP 5 μm column （4.6 mm×250 mm）was used at 40 ℃; mobile phase was methanol water（volume ratio 45：55）; the flow rate was 1. 0 mL/min; the detection wavelength was 218 nm; the injection volume was 20 μL. [Result]The method could achieve rapid separation of triptolide in about 8 minutes. A good linear was obtained within the range of 1.55-248.00 μg/mL（R2=0.999 7）， the average recovery was 99.6%（RSD=1.85%， n=6）.[Conclusion]The method is easy to operate， has fast analysis speed， good reproducibility and high accuracy， and can be used as a method for determining the content of triptolide. The order of total content of triptolide in different interplanting patterns is treatment 1>CK>treatment 2>treatment 3， and the order of triptolide in different parts of Tripterygium wilfordii is root>leaf>stem. It shows that the model of Tripterygium wilfordii under Magnolia officinalis can increase the content of triptolide， so it can be widely promoted as a high quality forest medicine interplanting pattern.

Key words Intercropping;Triptolide;Content determination;High performance liquid chromatography

雷公藤（Tripterygium wilfordii），是卫矛科常见的有毒蜜源植物，是我国传统医学中常用的中草药之一。雷公藤甲素，又名雷公藤内酯醇（triptolide，T10），外观呈白色针状结晶体，是雷公藤中含量最高、活性和毒性最强的二萜类原生化合物[1]，常作为需求量大的雷公藤片、雷公藤多苷片的主要成分[2]。临床研究发现，雷公藤甲素及其衍生物可通过多靶点多途径改善多种疾病，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗生育、抗病毒、神经组织保护等作用[3-4]。因其在科研的广泛应用和长期无序采挖致使野生资源急剧减少，供不应求[5]，即使雷公藤甲素可生物合成，但其存在合成路线长、获得率低、反应条件不易创造等局限性，所以从植物中提取雷公藤甲素依然是首要途径[6]。

林药间作套种模式是复合农林业生态系统的重要组成部分，既能提高林地利用率又可保证药用植物资源的合理化種植，可调整林分结构，增加林分内生物多样性，改善土壤条件，提高单位面积的生物总产量[7-10]，其在实现土地经济效益最大化的同时兼顾生态效益[11]。目前，有关雷公藤的研究多集中于其活性成分在临床医学研究中的应用，如Yang等[12]研究了甘草酸与雷公藤甲素联合使用以减轻脏器毒性，王烁阳等[13]利用雷公藤甲素改善内毒血症大鼠心血管功能损伤，仅张亮等[14]、李汉保等[15]研究了雷公藤不同部位的雷公藤甲素含量差异较大。但针对雷公藤生态栽培模式影响雷公藤甲素含量的研究较少，因此笔者以套种在厚朴、杉木、马尾松林下的雷公藤及雷公藤纯林作为试验对象，建立雷公藤甲素含量的测定方法，并对不同套种模式下的雷公藤不同部位甲素含量进行对比分析，以期为雷公藤甲素的提取与分离及雷公藤优质套种经营模式提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与地点

试验中均以6年生雷公藤作为试材，马尾松、厚朴、杉木均是同年栽植，长势良好。

设置4个处理：雷公藤纯林（CK）为对照组、厚朴和雷公藤套种（处理①）、杉木和雷公藤套种（处理②）、马尾松和雷公藤套种（处理③），样地规模均为20 m×20 m，3次重复。

试验地点为福建省三明市泰宁县杉城镇邱洪村（玉溪工区）雷公藤种植基地，位于26°56′N、117°09′E，亚热带季风气候，年均气温15.5～17.2 ℃，最高气温38.9 ℃，最低气温-10.6 ℃，年平均相对湿度84%，年平均降水量1 725～1 913 mm，壤土肥力中等，年平均无霜期214～252 d。

1.2 雷公藤甲素测定方法

1.2.1 色谱条件。

色谱柱为SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇-水（体积比45∶55）;流速：1.0 mL/min;检测波长：218 nm;柱温：40 ℃;进样量：20 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备。

精密称取24.80 mg雷公藤甲素标准品，置于50.00 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容于刻度线，充分摇匀，配成每1 mL含0.496 mg的标准品储备液。

1.2.3 供试品溶液的制备。

分别将采自5、7、9月的雷公藤根、茎、叶烘干、研磨、过筛（60目），各取2.00 g于三角瓶中，72 mL甲醇浸提12 h，过滤，蒸馏，加25 mL三氯甲烷萃取3次，旋转蒸发仪蒸干，加少量洗脱液（甲醇∶乙酸乙酯∶乙醚=1∶2∶1）洗脱，超声，溶解残渣。加入中性氧化铝于层析柱，待溶液经过层析柱，等量洗脱液洗脱2次，层析完毕，蒸干溶液，甲醇定容至10 mL，滤膜过滤，滤液作为供试品溶液备用。

1.2.4

阴性对照品溶液的制备。取按处方量除去雷公藤甲素制备样品，并按“1.2.3”供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2 方法学考察

2.1 专属性考察

在检测波长218 nm、柱温40 ℃、进样量20 μL、流动相为甲醇-水（45∶55）的高效液相色谱条件下，分

别精密吸取对照品溶液、阴性对照品溶液、供试品溶液各20 μL，按“1.2.1”色谱条件进行HPLC分析，结果表明（图1～

3），阴性对照溶液在雷公藤甲素标准品色谱峰保留时间段

未出现色谱峰，表明阴性对照无干扰;且分离度达到10.17，理论塔板数不低于1 800，符合要求，表明此方法的专属性较强。

2.2 线性关系考察

分别精密吸取标准品溶液0.031 25、0.062 50、0.125 00、1.250 00、2.500 00、5.000 00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。

在“1.2.1”的色谱条件下，吸取各浓度的标准品溶液，分别进样20 μL，测得峰面积，以溶液浓度（x）对峰面积（y）做线性回归，得出线性回归方程y=0.011 6 x+1.359 6（R2=0.999 7），说明雷公藤甲素浓度在1.55～248.00 μg/mL线性关系良好。

2.3 精密度试验

吸取496 μg/mL雷公藤甲素对照品溶液20 μL，连续进样5次，测定峰面积，计算雷公藤甲素峰面积的相对标准偏差RSD为1.04%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

吸取“1.2.3”配制的雷公藤甲素供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、14、18、24 h分别测定一次，计算雷公藤甲素峰面积的RSD为0.96%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验

取同时期制备的供试品溶液，重复进样5次，测定峰面积，计算雷公藤甲素峰面积的RSD为0.96%，表明该方法重现性良好。

2.6 加样回收率试验

分别精确称量雷公藤供试样品2.00 g，平行6份，按相同质量浓度精确加入0.496 mg/mL雷公藤甲素对照品溶液，相同的方法测定峰面积，计算回收率，结果发现平均加样回收率为99.6%，RSD为1.85%。

2.7 样品测定

按“1.2.3”方法制得雷公藤不同部位的供试样品溶液，再依“1.2.1”色谱条件进样20 μL，计算含量，结果详见表1。从表1可以看出，5、7、9月不同套种模式下雷公藤不同部位甲素含量从高到低依次为根、叶、茎。处理①、处理②、处理③、CK对照组3个月的甲素总含量分别为9.754 6、6.754 5、5.196 1、7.526 7 μg/mL，处理①的甲素含量最高，相比CK对照组高出29.61%，处理②和处理③的甲素含量较CK对照组分别降低10.26%、30.97%。同时还可看出，9月份4种处理的甲素含量均升高到最高，其中处理①的甲素含量极高（4.492 7 μg/mL），幾乎为处理②和处理③的2倍。雷公藤在5—9月进入生长期尤其是快速生长期，次生代谢较快，代谢产物甲素逐渐积累，于9月份甲素含量达到最高。

3 讨论与结论

在200～450 nm处对雷公藤甲素进行测定，发现在218 nm处有最大吸收，因此选定218 nm为测定波长。选用甲醇-水（体积比45∶55）为流动相，能使雷公藤甲素与其他活性成分保持稳定的游离状态，峰形对称。通过对多次均衡进样后的峰面积进行分析，发现进样量为20 μL时，峰面积没有明显的变大或变小，较为稳定。

样品溶液的出峰时间较对照品出峰时间推迟了约0.4 min，且出现了不同程度的杂质峰，原因可能是样品溶液的制备过程中混有少量杂质，污染了色谱柱，使柱效降低，但对雷公藤甲素含量及出峰面积没有影响。

试验结果表明，不同套种模式下雷公藤甲素含量差异较大，相比雷公藤纯林，厚朴林下套种的雷公藤甲素含量提高了29.61%，而杉木、马尾松林下套种的雷公藤甲素含量则分别降低了10.26%、30.97%;根据样品溶液的出峰现象，发现同种处理下，雷公藤根对应的峰最高、面积最大，叶次之，茎出峰面积最小，因此雷公藤不同部位甲素含量从高到低依次为根、叶、茎。孙乙铭等[16]测定了不同采收年限雷公藤不同部位的甲素含量发现根皮甲素含量最高、叶片次之，这与该研究的结果基本一致。涂育和等[17]测定了林下套种雷公藤的厚朴林的胸径和树高，发现其比厚朴纯林分别高出了14.55%和7.43%。厚朴林下套种雷公藤，雷公藤的生长表现出了较高的优越性，然而厚朴也具有较高的药用价值，多作为中药制剂应用于临床医学，但现阶段仅对套种模式中厚朴的形态特征有少量研究，雷公藤对厚朴的药用成分是否有影响需进一步研究。

下雷公藤不同部位甲素含量

参考文献

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