人参内生假单胞菌G13476分离筛选及其抗肿瘤效果研究

鞠鑫 钱玮 胡翠英 马雪香 王桃云 郭伟强

摘要 [目的]从人参中找寻具有抗肿瘤活性的内生菌，并研究其抗肿瘤效果和机制。[方法]使用假单胞菌基础培养基进行分离，通过16s rDNA分子鉴定，采用MTT比色法、western blot等在乳腺癌细胞MDA-MB-231胞系中检测抗肿瘤活性。[结果]所分离菌株G13476经BLAST比对，确定其为假单胞菌;MTT数据和western blot结果显示，菌株G13476通过下调Bcl-2、上调Bax实现对三阴性乳腺癌的抑制。[结论]该研究结果为人参内生假单胞菌G13476在抗肿瘤药物的开发和应用提供技术支撑和理论基础。

关键词 人参;内生菌;假单胞菌;分离筛选;抗肿瘤;三阴性乳腺癌

中图分类号 R 284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0193-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.056

開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and Anti tumor Effect of Endophytic Pseudomonad G13476 in Ginseng

JU Xin，QIAN Wei，HU Cui ying et al （School of Chemistry，Biology and Material Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou，Jiangsu 215009）

Abstract [Objective]The research aimed to find endophytic bacteria with anti tumor activity from ginseng and study its anti tumor effect and mechanism.[Method]Pseudomonas basal culture medium was used for isolation，molecular identification was analyzed by 16s rDNA，the anti tumor effect and mechanism were measured by MTT assay and western blot in MDA MB 231 cells.[Result]The isolated strain G13476 was aligned by BLAST to determine that it was pseudomonas;MTT data and western blot results showed that strain G13476 inhibited triple negative breast cancer by down regulating Bcl 2 and up regulating Bax.[Conclusion]The results of this study provide technical support and theoretical basis for the development and application of anti tumor drugs by pseudostellaria genus G13476.

Key words Ginseng;Endophytic bacteria;Pseudomonad;Isolation and screening;Anti tumor;Triple negative breast cancer

癌症严重危害人民群众身体健康，如肺癌、肝癌、乳腺癌等。乳腺癌是十大恶性肿瘤之一，尤以三阴性乳腺癌危害更重[1]。目前，三阴性乳腺癌因缺少合适的治疗靶点，致使治疗效果差、死亡率高[2]。因此，找寻新的抗癌药物一直是研究热点和重点。

人参，属五加科植物，在我国有数千年的药用历史，是传统名贵药材。人参具有调气血、安精神、止惊悸等功效。近年来，现代药理扩大人参的应用范围和价值，研究发现人参具有抗肿瘤、抗炎症、抑菌等作用[3-4]。人参皂苷Rg1通过抑制AMPK/mTOR/PI3K通路减少血管紧张素Ⅱ诱导足细胞的自噬现象[5];人参皂苷Rg3下调胰岛素一号增长因子的分泌，实现对骨髓瘤细胞的增殖抑制[6];人参皂苷Re在人永生化表皮细胞HaCaT中，能够调控丝蛋白和半胱天冬酶-14（caspase-14）促进皮肤的保护功能[7];人参皂苷Rh2在结肠癌荷鼠抑制瘤模型中能够减轻肿瘤相关抑郁症状[8]。

内生菌（endophyte）是一类可在植物体内生存的微生物，且对宿主植物友好，不造成任何伤害。内生菌因其次生代谢产物中可能含有与宿主植物相同或相似的活性成分，而成为研究的热点和重点[9]。因此，笔者研究从人参内生菌中分离的一株假单胞菌在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的抗肿瘤活性和潜在作用机制，以期为以该菌为基础开发新型抗肿瘤药物提供理论依据和试验支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜人参购自安徽亳州中药市场;MDA-MB-231细胞株为苏州科技生物实验中心保存;RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司;细菌总DNA提取试剂盒、Taq酶购自天根生化科技（北京）有限公司;引物合成、基因测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。蛋白胨、牛肉粉、氯化钠、乙酸乙酯等试剂购自国药集团。

假单胞菌基础培养基：明胶胨 16.0 g、蛋白胨 10.0 g、硫酸钾 10.0 g、氯化镁 1.4 g、溴化十六烷基三甲胺 0.2 g、琼脂粉15 g，双蒸水定容至1 L，pH调节至7.2，121℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 人参表面消毒及培养。

新鲜人参根茎经由自来水冲洗后，用50%乙醇处理15 s，75%乙醇处理30 s。随后，将人参于1% NaClO溶液中浸泡3 min，无菌水冲洗3～5次，收集冲洗废液。将人参根茎剪成5 mm的小段置于固体假单胞菌基础培养基中，于隔水式干燥培养箱中，28 ℃培养14 d左右。随后，进行单菌落分选。

1.2.2 人参内生细菌总DNA提取和16s rDNA扩增。

将所分离的单菌落进行摇瓶培养，28 ℃，100 r/min培养3 d后，10 000 r/min离心1 min后，在菌体沉淀中加入200 μL缓冲液GA和20 μL蛋白酶K，振荡;加入220 μL缓冲液GB，振荡15 s后70℃水浴10 min;加入220 μL无水乙醇，振荡15 s，转至吸附柱中，随后按说明书进行操作。使用紫外微量分光光度计检测所提DNA的浓度和质量。

以所提DNA为模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。20 μL PCR扩增体系如下：2.0 μL 10×Taq Buffer（with Mg2+），1.5 μL 10 mmo/L dNTPs，0.5 μL 10 mmol/L 27F，0.5 μL 10 mmol/L 1492R，0.2 μL Taq酶，1.5 μL模板DNA，加无菌水补至20 μL。扩增条件为：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环;72 ℃ 10 min。擴增所得PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳检测并回收。所回收的PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。

1.2.3 次生代谢产物提取。收集上述假单胞菌培养液5 L，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取物，经旋转蒸发和冷冻干燥，得到粗提物，称重后，-20 ℃保存。

1.2.4 MDA-MB-231细胞培养及MTT活力检测。

MDA-MB-231细胞贴壁培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2中培养。取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，接种于96孔板中，使每孔细胞数量为3×103个/100 μL。加入不同浓度粗提物（DMSO溶解），终浓度为0、0.5、2、8、32 μg/mL，每浓度设置3个平行孔。37 ℃、5% CO2下分别培养24、48 h后，弃上清，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h后，加入100 μL DMSO，使用酶标仪于570 nm处测定吸光度。

1.2.5 Western blot检测Bcl-2、Bax等相关蛋白含量变化。

取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，接种于6孔板中，根据MTT比色结果，选择32 μg/mL的粗提物进行刺激。刺激24 h后，提取总蛋白，经BCA定量后，取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，后转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，

分别加入一抗（Bcl-2、Bax和GAPDH）4 ℃孵育过夜，加HRP标记的二抗，室温孵育1 h，ECL显影。

2 结果与分析

2.1 人参内生假单胞菌G13476的分离与鉴定

人参表面经无菌处理后，经涂布分析显示灭菌彻底。使用假单胞菌基础培养基进行培养，分离单菌落G13476。提取该菌的基因组DNA，进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条大小约1 500 bp的特异性DNA片段，与细菌的16s rDNA长度一致（图1）。此片段经回收和测序，测序结果进行Blast分析，表明菌株G13476属假单胞菌属（图2）。

2.2 菌株G13476抑制MDA-MB-231细胞生长

将菌株G13476进行发酵培养，收集发酵液，经乙酸乙酯萃取，旋转蒸发和冷冻干燥浓缩，获得干粉，DMSO溶解，调整浓度至10 mg/mL。

由图3可见，菌株G13476粗提取对MDA-MB-231细胞有明显的抑制作用，随着浓度的增加，抑制率增加，且随着作用时间的延长，抑制率也随之增加。在作用24 h，2 μg/mL粗提取的抑制率约为 35%，32 μg/mL粗提取的抑制率约为51%。试验结果显示，菌株G13476对乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较好的抑制增殖作用。

2.3 菌株G13476调控Bcl-2和Bax蛋白含量

由图4可知，菌株G13476粗提物可有效抑制Bcl-2蛋白含量，同时提升Bax的蛋白含量，且10 μg/mL的调控效果明显优于2 μg/mL。结果表明，菌株G13476可通过调控Bcl-2和Bax显示抗肿瘤作用。

3 结论与讨论

该研究以人参为对象，从中分离假单胞菌株G13476，并在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中检测其抗肿瘤效果。结果表明，假单胞菌株G13476具有较好的抗肿瘤活性，终浓度32 μg/mL的G13476粗提物的抑制率为51%。

人参被称为“百草之王”，药用价值广泛，现代药理研究显示，人参具有抗肿瘤、抗炎症、增加免疫力等作用。但因价格、虫害等因素阻碍了人参的应用及推广。近年来，随着对内生菌研究的深入，人参内生菌中含有与人参功效相似的次生代谢产物，使其人参内生菌成为热点研究领域之一。田磊等[10]从人参内生细菌中筛选到1株具有较为ACC脱氢酶活性的荧光假单胞杆菌;王卓等[11]发现2种人参内生真菌——GS-4和GS-22，其乙酸乙酯粗提物对人宫颈癌Hela细胞具有抑制作用，其半抑制浓度达60～140 μg/mL，这2种真菌分别属于半裸镰刀菌和半球菌。虽然有关人参内生菌的抗肿瘤活性和分离筛选研究较多，但有关内生假单胞菌的筛选和抗肿瘤活性研究较少。

乳腺癌是排位第一的女性常见恶性肿瘤，其发病率近年来出现升高且年轻化趋势。三阴性乳腺癌是乳腺癌中较为特殊的一种类型，其雌激素受体、孕激素受体、HER-2受体均为阴性，因缺乏合适的治疗靶点，导致其死亡率高于其他类型。因此，找寻乳腺癌（特别是三阴性乳腺癌）的新型治疗药物或手段成为研究热点和重点[12-13]。相关文献报道显示，蒲公英提取物对三阴性乳腺癌细胞具有良好的抑制效果[14];中药西黄丸可有效抑制三阴性乳腺癌细胞株Hs578T的增殖[15]。该研究以三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231为受测细胞，采用MTT比色法分析所分离的假单胞菌株G13476的抗肿瘤活性，结果表明，菌株G13476具有较好的抗三阴性乳腺癌活性。

B淋巴细胞瘤-2蛋白家族（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），是较早开展研究的肿瘤相关蛋白。其中Bcl-2是一种原癌基因，位于t（14∶18）染色体异位断裂处，其具有抗氧化、抑制凋亡等方面作用;Bax是一种促凋亡蛋白，其通过自身形成同源二聚体，进而破坏线粒体膜结构，进而激活caspase的级联反应，诱导细胞死亡。因此，Bcl-2长久以来被认为是抗肿瘤药物研究的热点和重点[16-17]。傅思莹等[18]研究发现桃红四物汤可有效降低侵润性乳腺癌中Bcl-2蛋白表达，提高Bax蛋白含量。该研究结果显示，人参内生假单胞杆菌G13476可通过下调Bcl-2蛋白含量、上调Bax蛋白含量，实现对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制。

综上所述，该研究从人参中分离获得一株具有抗肿瘤活性的菌株G13476，经鉴定为假单胞杆菌属，并在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，发现其次生代谢产物可通过调控Bcl-2、Bax蛋白，实现抑制作用。该结果为人参内生菌在抗肿瘤药物的开发和应用提供技术支撑和理论基础。

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