春大豆苗期低温胁迫下叶绿素荧光响应

田鑫　钟程　李性苑

摘要  [目的]探讨春大豆与低温胁迫有关的光合参数以及种质与低温之间的相关性。[方法]以5个春大豆品种的幼苗为试验材料，用叶绿素荧光测定仪测定低温胁迫后的叶绿素含量。[结果]5个春大豆品种的Fv（样品可变荧光）/Fm（样品最大荧光产量）和qP（光化学淬灭系数）均显著降低;与室温对照相比，F0（初始荧光）和qN（非光学淬灭系数）在低温胁迫下显著增加。与其他品种相比，骨粒青的Fo和qN均显著增大而Fv/Fm显著降低，qP下降但仍处于高水平。43号的Fo 增加最少。95-1的Fv/Fm最高，但qP最低。南农513的qN增加最少，属于低温敏感型材料。光氧化（qN）是引起南农513损伤的主要原因，而qP和qN反映出骨粒青能在低温下继续光合作用进行生长，以减少光氧化带来的损伤。[结论]qP和qN是用来评估大豆的低温抗性指标的较可靠的光合参数。

关键词  大豆;低温胁迫;叶绿素荧光;光抑制;光氧化

中图分类号  S565.1    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0028-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.010

Chlorophyll Fluorescence Response of Spring Soybean to Chilling Stress at Seedling Stage

TIAN Xin， ZHONG Cheng， LI Xing-yuan

（College of Comprehensive Health， Kaili University， Kaili， Guizhou 556011）

Abstract  [Objective]To explore correlation among the photosynthetic parameters under the chilling stress， as well as the correlation between germplasm and temperature. [Method]With seedlings of five spring soybean varieties as the test varieties， we detected the chlorophyll contents after temperature stress by chlorophyll fluorescence meter. [Result]Fv/Fm and qP of five spring soybeans all significantly reduced. Compared with the CK under room temperature， F0 and qN enhanced significantly，  and a significant increase in original fluorescence （Fo） and non-photochemical quenching （qN） Following chilling stress compared to room temperature controls. Compared to other soybeans，the Fo and qN increased the greatest and the yield and Fv/Fm decreased the greatest in the tolerant cultivar Guliqing. Interestingly， the qP declined， but remained at a high level. Fo increased the least in cultivar #43， but it still had a high yield. The Fv/Fm ratio was the highest in cultivar 95-1， but had the lowest qP. qN increased the least in chilling-sensitive cultivar Nannong 513. Taken together， photo-oxidation （qN） may be a major cause of damage in Nannong 513， resulting in its chilling sensitivity. In contrast， chilling tolerant cultivar Guliqing may maintain photosynthesis to maintain growth and reduce photo-oxidation damage， as reflected by parameters qP and qN. Thus， qP and qN may be the most reliable parameters to evaluate chilling resistance in soybeans.

Key words  Soybean;Chilling stress;Chlorophyll fluorescence;Photo-inhibition;Photo-oxidation

基金項目  贵州省科学技术基金“贵州省大豆突变体的人工诱导及高产、优质、多抗品种的选育”（黔科合J字〔2014〕2151）。

作者简介  田鑫（1983—），男，湖南凤凰人，副教授，博士，从事作物遗传育种研究。

收稿日期  2019-06-17

大豆是世界最重要的经济作物之一，是主要的油料植物。大豆是低温敏感型作物[1]，低温影响大豆的各个生育阶段，从而降低大豆的产量和品质[2-3]。低温胁迫影响光合机构的性能和活性[4]，最严重的危害是在高光效下抑制气孔开度和降低CO2的固定[5]，干扰光氧化再生，对低温的响应可抑制光合作用合成。此外，低温胁迫可降低电子链的氧化还原水平[6]，光合作用减弱可降低叶温、增加光合系统II敏感性，降低PSII电子传递和光能转化效率[7]，产生光抑制现象[8]，导致光氧化降解类囊体[9]。因此，研究低温胁迫对光合作用的影响是了解伤害机理的重要方面[8]。

低温是我国南方早春期间常见的逆境胁迫因子，极大影响了春大豆的出芽、成苗及幼苗的生长发育，延长了春大豆的生长期，对农业生产造成不利影响，因此有必要对春大豆材料进行低温耐性机制研究。目前，对春大豆的耐低温研究主要集中在东北三省大豆材料生育期的低温胁迫，但鲜见我国南方春大豆材料早春耐低温的研究报道。而提高春大豆耐低温性能力是选育春大豆优良种质的目标之一，通过快速准确地评估春大豆耐低温能力是低温育种的重要途径。叶绿素荧光仪可快速检测植株在胁迫下的光合作用[10]，通过荧光参数能够反映PSⅡ对光能的吸收、传递和耗散状况等生理过程。目前，该方法已广泛用于评估西瓜[11]、棉花[12]、玉米[13]等作物对低温响应的动态过程，但叶绿素荧光仪检测大豆的低温耐受力仍鲜见报道。鉴于此，笔者在低温胁迫下采用叶绿素荧光仪检测春大豆光合参数进行抗低温材料筛选，为早春培育壮苗提供技术支持，为引种和抗寒种质改良和品种选育提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

对41份大豆种质进行低温筛选，共获得发芽率高且苗期长势较好的5个春大豆品种[14]，包括南农513、骨粒青、青酥2号、43号、95-1。其中，南农513为低温敏感型，骨粒青是最耐低温型，青酥2号、43号和95-1属于中间型材料。

1.2  试验方法

1.2.1  生长条件。在人工气候室内进行常规种植，土∶沙∶蛭石=4∶2∶1，植株光照采用荧光灯和白炽灯2种，光照时间为光照∶黑暗=12 h∶12 h（25 ℃/18 ℃，相对湿度70%），CO2浓度为（398.65 ±20.47）μmol/mol（用Li-6400、LI-COR、USA检测获得），吸收的光通量密度为300 μmol/（m2·s），每2 d浇1次水，共生长30 d，

1.2.2

低温处理。当幼苗三出复叶展开时，选择长势一致、生长状态良好、无病虫害的植株进行低温处理，将每个材料分成2组，其中一组在低温培养箱中进行低温处理（5 ℃，相对湿度70%，光照∶黑暗=12 h∶12 h，连续处理4 d），CO2浓度为（405.05 ±25.86）μmol/mol，其他条件按常规进行;另一组室温生长。

1.2.3  叶绿素荧光测定。在第1片三出复叶完全展开时，分别测定0，1，2，3和4 d低温处理（5 ℃）的叶绿素荧光参数，以相应的时间梯度室温（25 ℃）为对照。利用红外气体分析仪监测平均CO2浓度控制在405 μmol/mol以降低试验误差，参数测定重复6次，叶绿素荧光测定按照脉冲幅度调制荧光计说明书使用（PAM 2100，H.Waltz，Effeltrich，Germany）[15]。测定前，叶片先暗适应30 min以排除光照误差。参数测定如下：叶绿素荧光（Fy）、初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）;暗适应后叶片光适应的量子产量阈值、光反应阶段荧光最大值（Fm）、光反应阶段光适应的最大值（Fm）和光稳定值（Ft）。利用这些参数计算光化学反应的利用效率：Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，光反应阶段光化学反应的光量子产率=（Fm-Ft）/Fm，叶绿素荧光的光化学淬灭qP=（Fm-Ft）/（Fm-Fo），叶绿素荧光的非光化学淬灭qN=（Fm– Fm）/（Fm–Fo）。

1.3  统计分析

所有数据采用单因素方差分析，差异显著性用邓肯测验。无特殊注明差异显著性分析均为P< 0.01。

2  结果与分析

2.1  低温胁迫对春大豆初始荧光（Fo）的影响

由图1可知，在整个低温处理暗适应阶段，对照处理的5个春大豆品种种子的Fo没有变化，而低温处理5个春大豆品种均产生不同程度变化，说明植物体光反应中心造成潜在伤害或可逆失活。其中，骨粒青的Fo增加最多，较对照提高了42%;95-1的Fo增加最少，仅有15%，说明低温胁迫对不同大豆品种Fo的影响程度不同。骨粒青受低温胁迫后光反应中心严重失活或损害，而95-1受到的伤害最轻。

2.2  低温胁迫对春大豆Fv/Fm的影响

由图2可知，对照植株在暗适应阶段Fv/Fm为0.80～0.84。低温胁迫后，各春大豆品种的Fv/Fm均降低，其中骨粒青下降最多，导致Fo显著增加、Fm降低;43號的Fv/Fm降低最小。室温条件下，春大豆品种对Fv/Fm没有显著影响，经过低温胁迫的春大豆品种Fv/Fm存在极显著差异。不同春大豆品种中，骨粒青的光反应中心受到的伤害最多，而43号最少。

2.3  低温胁迫对春大豆量子产量阈值、qP和qN的影响

量子产量阈值是光系统II中光化学能转化成光量子的效率。由图3可知，低温胁迫下5个春大豆品种的量子产量阈值均急剧降低，说明暗适应阶段春大豆光合效率很低。其中，骨粒青量子产量阈值下降最多，而43号下降最少。室温处理下，不同春大豆品种间量子产量阈值存在极显著差异，说明低温处理量子产量阈值受种质和温度的交互影响。

2.4  低温胁迫对春大豆qP的影响

叶绿素荧光的光化学淬灭（qP）是光系统II中天线色素吸收能量的比例。由图4可知，低温胁迫下5个春大豆品种的qP均显著降低。其中，低温处理下春大豆品种骨粒青的qP最高，而95-1最低。室温处理下，南农513暗适应阶段的qP较低。

2.5  低温胁迫对春大豆qN的影响

由图5可知，低温胁迫下，骨粒青的叶绿素荧光的非光化学淬灭（qN）极显著高于其他春大豆品种，而南农513的qN最低。由此可见，骨粒青通过辐射耗散释放多余能量，从而避免光氧化伤害;南农513保持相对较高的光合作用，受到严重的光氧化伤害，导致不同春大豆品种间耐低温能力有差异。

3  结论与讨论

3.1  低温胁迫下的Fo、Fv/Fm和阈值

前人研究表明，光合作用的Fv/Fm可作为判断低温胁迫和低温抗性的依据[16-19]，Fv/Fm还适用于低温抗性植株或低温抗性研究。此外，越来越多的证据表明Fv/Fm适用于低温不敏感型作物，并且不能把参数作为筛选抗低温植物的标准[18]。光反应中心严重受损时，Fv/Fm不一定会下降，通常Fv/Fm降低是由于光反应中心受低温冷害在短期内暂时失活以避免光氧化造成的伤害，短期（0～7 d）内温度降到0 ℃以上时，植物因缺乏能量而生长暂时受到抑制，然而冰点温度严重影响细胞组织，植物体内结冰导致组织紧缩和细胞浓度增大，细胞体内有毒离子积累和细胞膜损伤造成细胞死亡[19]，冷害比冻害的危害要轻一些，由于没有结冰的影响，尽管细胞膜的流动性减少，短期冷害是可以恢复的。但长期低温条件下质壁分离不能维持正常离子浓度，细胞代谢紊乱导致细胞死亡[20-21]。

因此，大豆受低温冷害时会影响光反应中心的光利用效率，Fo、Fv/Fm和阈值参数能较好反应光反应中心的活性，但与低温冷害无相关性。该试验结果表明，骨粒青的低温抗性表现在随着低温时间的延长，光反应中心活性逐渐降低，两者间的上升和下降表明光合能力并不是决定低温抗性主要因素，Fo、Fv/Fm和阈值参数并不能作为评估大豆低温抗性的可靠依据。

3.2  低温胁迫下的qP和qN

低温敏感植物的光合作用和光饱和点在低温胁迫时急剧下降，白天光照过强会导致光抑制，引起光系统II中的捕光色素蛋白复合物构象改变和降解[22]，光抑制是通过吸收的能量过度耗散或光系统II D1反应中心蛋白损坏造成光系统II可逆降解[23]。此外，光抑制与能量过度耗散和光合结构受损过程有关，是植物体自身的保护机制[18，24]。qN表示能量以热能形式耗散，反映光强过强产生光抑制，如果光抑制较低，光合系统损害较小;qP是衡量开放的光系统II反应中心的光抑制程度。综上所述，qP和qN可以判断植物自我保护能力。

此外，光抑制、低温、光强增强可能对光合膜吸收能力造成损害，引起类囊体光氧化降解[25]，黑暗低温伤害的程度不同，光和氧气依赖于光氧化表明光合作用的光反应可能产生一种或多种有毒的活性氧，这些活性氧对生物体造成明显伤害。植物通过进化叶绿体的淬灭机制来减少有毒物质对机体的破坏，有30%～40%的细胞抗壞血酸、10%～50%的谷胱甘肽以及所有的α维生素E和β胡萝卜素都位于叶绿体，虽然它们只占叶肉细胞体积的3%～4%[26]，但这些复合物能够清除植物活性氧。报道显示，低温敏感型植物容易产生活性氧[26]，此外低温敏感型植物在低温、抗氧化剂环境下不能处理积累的活性氧，并且在早期会因过氧化氢的产生而导致机体受损，光氧化是植物发生氧化伤害的一种机制。

该研究结果显示，与其他4个大豆品种相比，在低温冷害期骨粒青的qN增加幅度较大，且qP始终处于较高水平，说明骨粒青的光合效率较低，但光系统II反应中心仍然能使光合作用产生能量维持植物的正常生长。此外，能量过度耗散能有效抑制QA的过度降低[27]，有效减少光氧化带来的伤害，骨粒青的qP和qN最高，南农513的 qN较其他材料极显著降低，说明南农513能吸收更多能量，产生大量活性氧，导致存活率降低，此外还发现过度的能量耗散和抗氧化是判断大豆低温抗性的最重要因素。

3.3  叶绿素荧光评估大豆的低温抗性

早春时植物易受低温、光抑制、光氧化以及其他因素的交替影响，如温度、降雨、光照、湿度、风、病害等。人为低温胁迫试验允许操控植物低温的耐受性，有研究用Fv/Fm来评估植物的低温抗性[16-17，22，24]，这种方法适用于生长在低温条件下的低温抗性材料，通过其光合效率的不同机制来提供能量，从而维持长期低温冷害。因此，低温抗性植物继续进行光合作用以维持抗性机制，尽管低温敏感型植物可以耐受短期低温，但不能长期在低温条件下存活，低温敏感型植物面临的最大问题是氧化还原系统紊乱和活性氧伤害。因此，低温敏感型植物短期低温下存活的重要因素是具有有效的抗氧化系统。

植物的抗氧化系统很复杂，然而叶绿素荧光反映出抗氧化系统在某种程度上可以代替现有的低温测试，植物存活分析较敏感和客观，而低温测试存在较大的误差和延迟[10]。与离子释放测试试验相比，叶绿素荧光方法具有不破坏性和简单易测的特点，因此叶绿素荧光适用于育种中评估大规模材料的低温抗性，但叶绿素荧光测试的材料具有种间差异，如耐低温作物燕麦的Fv/Fm和低温敏感型作物大豆的qP和qN均可测。

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