免疫性血小板减少症气不摄血证小鼠模型血管内皮活性物质变化动态研究

武曲星 王攀 王冬芝 蔺亚东 张伏芝 刘建勋 任钧国

摘要：目的  從血管内皮活性物质角度探讨免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）气不摄血证血管损伤情况及出血机制的动态变化。方法  采用睡眠剥夺复合免疫法制备ITP气不摄血证小鼠模型，第1周进行睡眠剥夺，第2、3周睡眠剥夺同时注射抗血小板血清（APS）进行免疫。将Balb/C小鼠分为正常组和模型组，各组再分为7、10、21 d 时间点，每个时间点正常组10只、模型组12只，观察各时间点小鼠体征，检测小鼠体质量及血小板、抓力、脾脏指数、胸腺指数，ELISA检测血清血管性血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）含量，AimPlex流式高通量多因子法检测血管内皮生长因子-A（VEGF-A）、可溶性细胞间黏附分子-1（sICAM-1）、可溶性血管细胞黏附分子-1（sVCAM-1）含量。结果  与正常组比较，模型组第7日小鼠精神状态萎靡，倦怠蜷缩，极少活动，此状态随时间延长日益加重，体质量、抓力、血小板、脾脏指数、胸腺指数显著降低（P<0.01），vWF、NO、ET-1显著升高（P<0.01）;注射APS后，模型组小鼠腹部、腿部有出血点，便血情况发生，第2次注射后出血最为严重，此后逐日减轻，小鼠体质量、抓力、血小板、胸腺指数、VEGF-A、sVCAM-1显著降低（P<0.01，P<0.05），脾脏指数、vWF、NO、ET-1显著升高（P<0.01）;第21日模型组小鼠出血较轻，体质量、抓力、血小板、胸腺指数显著降低（P<0.01），脾脏指数、vWF、NO、ET-1、sICAM-1显著升高（P<0.01）。结论  ITP气不摄血证小鼠模型存在血管损伤：造模第7日以血管内皮凝血功能紊乱为主，第10日以血管内皮通透性改变为主，第21日以血管内皮免疫功能紊乱为主。

关键词：免疫性血小板减少症;气不摄血证;血管活性物质;病证结合模型

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）12-0056-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.013   开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Dynamic Study on Changes of Vascular Endothelial Active Substances in Mice Model of Immune Thrombocytopenia with Syndrome of Qi Failing to Control Blood

WU Quxing^1，2， WANG Pan²， WANG Dongzhi²， LIN Yadong²， ZHANG Fuzhi^1，2， LIU Jianxun²， REN Junguo²

1. Graduated School， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2. Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica， Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China

Abstract： Objective To explore the dynamic changes of vascular injury and bleeding mechanism of immune thrombocytopenia （ITP） with syndrome of qi failing to control blood from the perspective of vascular endothelial active substances. Methods ITP with syndrome of qi failing to control blood model was built by sleep deprivation combined with immunoassay. Mice were subjected to sleep deprivation at week 1 and sleep deprivation with immunization with anti-platelet serum （APS） at week 2 and 3. Mice were divided into normal group and model group， and divided into three time points： 3 d， 10 d， 21 d. There were 10 mice in the normal group and 12 mice in the model group at each time point. Body signs of each time point were observed and body weight， platelet， grip， spleen index， and thymus index were recorded. vWF， NO and ET-1 were measured by ELISA. VEGF-A， sICAM-1， sVCAM-1 were measured by AimPlex flow high-throughput multifactor. Results Compared with the normal group， after 7 days of sleep deprivation， mice in the model group were mentally depressed， tired and curled up with little activity. This state increased with the deprivation time. The body weight， grip， platelet， spleen index and thymus index of the mice significantly decreased （P<0.01）， and vWF， NO and ET-1 significantly increased （P<0.01）. After the injection of APS， the bleeding point appeared in the abdomen and legs of the mice and hematochezia occurred in mice. After the second injection， the bleeding was the most serious， and then decreased day by day， the mouse weight， the grip， the platelets， thymus index， VEGF-A and sVCAM-1 significantly decreased （P<0.01， P<0.05）， and the spleen index， vWF， NO and ET-1 significantly increased （P<0.01）. There was less bleeding on the 21st day. The body weight， grip， platelet and thymus index of the mice significantly decreased （P<0.01）， and the spleen index， vWF， NO， ET-1 and sICAM-1 significantly increased （P<0.01）. Conclusion Vascular injury is found in the model of ITP with syndrome of qi failing to control blood. On the 7th day， vascular endothelial coagulation dysfunction is dominant， on the 10th day， change of vascular endothelial permeability is dominant， and on the 21st day， vascular endothelial immune dysfunction is dominant.

2.2  造模

在前期研究基础上，采用睡眠剥夺复合免疫方法^[8-10]进行造模。睡眠剥夺：将小鼠置于自制水平台（水平台规格：平台高40 mm、底盘直径60 mm、中间竖管直径10 mm、顶盘直径25 mm）上，每笼4个水平台，放置3只小鼠。使用铁丝网将睡眠剥夺笼盖住并固定，保证小鼠无法逃脱，但可以移动。食物与饮用水瓶置于铁丝网食槽内，使小鼠可自由摄食饮水，若小鼠进入睡眠状态，会因肌肉松弛而落入水中，从而使小鼠始终保持清醒状态。采取随机时间段剥夺方法，平均每日剥夺19 h。每日剥夺结束后，将小鼠取出，放回鼠笼。免疫：按100 μL/20 g腹腔注射APS，隔日1次，共注射7次。造模：第1周进行睡眠剥夺，第2、3周睡眠剥夺复合注射APS免疫。

2.3  分组

将雄性Balb/C小鼠分为正常组和模型组，各组再分为7、10、21 d共3个时间点，正常组每个时间点各10只，模型组每个时间点各12只。模型组睡眠剥夺7 d后，在睡眠剥夺同时，每隔1 d注射APS;正常组每隔1 d注射生理盐水。每个时间点结束后，小鼠摘眼球取血，常规制备血清，-80 ℃冰箱贮藏备用，进行相应指标检测。

2.4  检测指标

2.4.1  小鼠体征

观察小鼠精神状态、毛色、大便、出血情况等。

2.4.2  体质量

测量小鼠体质量。

2.4.3  抓力

使用大小鼠抓力测定仪测定小鼠抓力。

2.4.4  血小板计数

取小鼠尾静脉血，使用全自动血细胞分析仪测量血小板数量。

2.4.5  脏器指数

小鼠麻醉，取脾脏、胸腺，生理盐水冲洗后称重。计算脏器指数。脏器指数（%）=脏器湿重（g）÷小鼠体质量（g）×100%。

2.4.6  ELISA检测血清血管性血友病因子、一氧化氮和内皮素-1含量

-80 ℃冰箱取出小鼠血清，按ELISA试剂盒说明书进行操作，检测小鼠血清vWF、NO、ET-1含量。

2.4.7  流式法检测血清血管内皮生长因子-A、可溶性细胞间黏附分子-1、可溶性血管细胞黏附分子-1含量

-80 ℃冰箱取出小鼠血清，按AimPlex流式高通量多因子检测试剂盒说明书进行操作，检测小鼠血清VEGF-A、sICAM-1、sVCAM-1含量。

3  统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，组间比较用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  結果

4.1  体征变化

正常组小鼠精神状态良好，反应敏捷，活动性良好，毛色纯白有光泽，大便呈黄褐色，条状，颗粒清晰。第7日模型组小鼠精神状态萎靡，反应迟钝，每日停止睡眠剥夺后，倦怠蜷缩，极少活动，毛色黯黄粗糙，大便呈黑褐色或黄色，便稀，随时间延长日益加重。第10日（注射APS后3 d），小鼠腹部、腿部出现出血点（见图1），便血情况出现，第2次注射后，小鼠出血最为严重，此后逐日减轻，第21日已无出血情况。

4.2  体质量变化

与正常组比较，模型组小鼠3个时间点体质量均显著降低（P<0.01），见表1。

4.3  抓力变化

与正常组比较，模型组小鼠3个时间点抓力均显著降低（P<0.01），见表2。

4.4  血小板计数变化

与正常组比较，模型组小鼠3个时间点血小板计数均显著降低（P<0.01），其中第10日模型组血小板计数最低，见表3。

4.5  脾脏指数变化

与正常组比较，模型组小鼠第7日脾脏指数显著降低（P<0.01），第10、21日脾脏指数显著增加（P<0.01），随着造模时间延长，模型组脾脏指数逐渐升高，见表4。

4.6  胸腺指数变化

与正常组比较，模型组小鼠3个时间点胸腺指数显著降低（P<0.01，P<0.05），见表5。

4.7  血清血管性血友病因子、一氧化氮和内皮素-1变化

与正常组比较，模型组小鼠3个时间点vWF、NO、ET-1均显著升高（P<0.01），见表6～表8。

4.8  血清血管内皮生长因子-A、可溶性细胞间黏附分子-1和可溶性血管细胞黏附分子-1变化

与正常组比较，模型组小鼠第7日VEGF-A、sICAM-1、sVCAM-1含量差异均无统计学意义（P>0.05），第10日VEGF-A、sVCAM-1含量显著降低（P<0.01），第21日sICAM-1含量显著升高（P<0.01），VEGF-A、sVCAM-1含量差异无统计学意义（P>0.05），见表9～表11。

5  讨论

气是构成人体和维持人体生命活动的精微物质，血为脉管中流动的红色液体，二者相互作用，保证人体机能的正常运行。在中医理论中，血证有广义与狭义之分，其中广义的血证是指与血液有关的疾病，狭义的血证是指由于各种原因导致的血不循经，溢出脉外。气不摄血是血证的常见病机，其辨证要点为出血和气虚。由于气的统摄作用，血液才可循行脉中，若气虚无法统摄，血溢脉外，则会出现各类出血。

ITP为临床常见的出血性疾病，由于自身免疫系统识别血小板表面糖蛋白并进行清除或影响血小板生成，造成血小板数量暂时或持续减少。气不摄血证是ITP主要的证型之一。目前，ITP动物模型造模方法较多，如注射APS^[9]、抗原模拟法^[11]等，但尚无对ITP气不摄血证小鼠模型的研究，通过对CBA/J小鼠腹腔注射哺乳后雌性Wistar大鼠提纯后血小板，采用睡眠剥夺复合免疫方法进行造模，出现气虚与血小板计数下降症状，但并未出现出血症状^[10]。仅注射APS便可出现较为明显的出血症状，说明此方法可能对血管造成较大影响，为更好研究ITP气不摄血证小鼠血管内皮的变化，本实验采用水平台睡眠剥夺法复合注射APS进行造模。

本实验以小鼠体征、体质量及抓力作为判断小鼠气虚指标。实验结果显示，睡眠剥夺第7日，模型组小鼠已出现精神状态萎靡不振、反应迟钝、倦怠蜷缩等症状，体质量、抓力明显下降，表明睡眠剥夺7 d已出现气虚症状，随时间延长，气虚症状加重。注射APS后，模型组小鼠血小板迅速下降，出现较为明显的出血点，并且有便血情况发生，表明存在消化道出血。此后隔日注射APS，出血情况日益减轻。

脾脏与胸腺是重要的免疫器官，脾脏也是血小板消除的主要器官。实验结果显示，睡眠剥夺第7日，小鼠脾脏指数、胸腺指数均显著降低，表明睡眠剥夺可明显降低免疫功能;注射APS后3 d（第10日），小鼠脾脏指数显著升高，并随着剥夺和注射时间的延长，小鼠脾脏指数逐渐升高，而胸腺指数则仍然显著降低，提示脾脏指数的升高主要是由血小板消除导致的，机体的免疫功能仍然处于低下状态。

在睡眠剥夺7 d后，模型组小鼠血小板明显降低，表明仅进行睡眠剥夺造成小鼠气虚状态，也会出现血小板降低的情况。注射APS后，模型组小鼠血小板迅速下降。此后隔日注射APS，血小板出现缓慢回升，通过注射APS可维持较低的血小板计数。

vWF是一种大分子糖蛋白多聚体，多由内皮细胞产生，少部分由巨核细胞产生^[12]，其作用主要是诱导血小板的黏附与聚集，作用于血管内皮损伤部位，促进凝血;稳定凝血因子Ⅷ，作为载体形成复合物^[13-14]。vWF浓度可在一定程度上作为血管内皮损伤程度的标志物^[15]。与正常组比较，模型组血清vWF含量显著升高，表明仅进行睡眠剥夺，血管内皮已有一定程度的损伤，注射APS和持续睡眠剥夺维持了持续性的损伤。

NO和ET-1是人体内广泛存在的一对信号分子，在调节血管、传递神经信号、调节免疫系统等方面均起到重要的作用。与健康对照组比较，临床ITP患者的NO/一氧化氮合酶（NOS）与活性氧均显著升高，且二者呈正相关^[16]，推测NO/NOS可能是通过参与ROS产生，并增加内皮细胞通透性^[17-18]。睡眠剥夺7日后，二者显著升高，说明小鼠内皮遭到损伤。注射APS和持續睡眠剥夺维持了较高的NO和ET-1水平。

VEGF是人体内作用最强的增加血管内皮细胞通透性因子^[19]，VEGF家族有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C等多种亚型。在不同的出血性疾病中，VEGF表达各不相同^[20]。本实验第10日模型组VEGF-A水平显著降低，是由于开始注射APS，产生的刺激较强，内皮损伤较单纯睡眠剥夺更严重，VEGF-A迅速下降。

ICAM-1与VCAM-1均为黏附分子，二者均属免疫球蛋白超家族。ICAM-1的作用为促进免疫细胞活化，诱导淋巴细胞在血管内皮进行黏附，是淋巴细胞与内皮细胞黏附的核心分子^[21]。正常情况下，ICAM-1几乎不在内皮细胞上进行表达。当有免疫反应发生时，分泌增多。VCAM-1与ICAM-1作用类似，可促进白细胞向血管内皮黏附。模型组第10日sVCAM-1显著降低，第21日sICAM-1血清浓度显著升高。表明第10日主要是血管内皮出现异常，但并未出现sVCAM-1介导的免疫反应，后期出现sICAM-1介导的淋巴细胞黏附，导致内皮细胞活化，增强内皮细胞通透性，使淋巴细胞更容易穿透血管内皮。

综上，ITP气不摄血证小鼠血管内皮受到一定程度损伤。在整个造模过程中小鼠vWF、NO、ET-1均升高，说明NO、ET-1异常贯穿整个造模过程;第10日（注射APS后3 d）VEGF-A和sVCAM-1水平显著降低，此时间点出血最为严重，说明血小板下降迅速，导致内皮功能受损，VEGF-A与sVCAM-1的降低与出血有关;第21日sICAM-1显著升高，说明造模后期小鼠机体反应以免疫反应为主，对内皮细胞的损伤主要是由sICAM-1诱导的淋巴细胞黏附造成。

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（收稿日期：2019-04-16）

（修回日期：2019-06-13;編辑：华强）