五味子乙素对NAFLD细胞模型肝脂质堆积、内质网应激信号通路蛋白及脂肪酸合成相关基因表达的影响

尉捷 董艳敏 王辉 王育林

摘要：目的  觀察五味子乙素（SchB）对非酒精性脂肪肝（NAFLD）肝脂质堆积、内质网应激信号通路蛋白及脂肪酸合成相关基因表达的影响，探讨其降脂作用机制。方法  培养正常人L02细胞株，加入游离脂肪酸的混合物（油酸∶软脂酸=2∶1），培养24 h诱导肝脂肪变性，建立NAFLD细胞模型。给予不同浓度SchB干预细胞模型，流式细胞术检测脂肪堆积，检测三酰甘油（TG）含量，Western blot检测内质网应激信号通路相关蛋白Bip、PERK、p-PERK、p-eIF2α、SREBP-1的表达，RT-PCR检测脂肪酸合成相关基因硬脂酰CoA去饱和酶（SCD）、甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）、乙酰CoA羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）的表达。结果  体外实验成功建立L02细胞脂肪堆积模型。与模型组比较，SchB组脂质堆积显著降低（P<0.05），且SchB可剂量依赖性降低TG水平，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;模型组较对照组Bip、SREBP-1、p-PERK、p-eIF2α蛋白和ACC、FAS、GPAT基因表达均上调，SCD基因表达下调;与模型组比较，SchB各浓度组内质网应激信号通路蛋白和ACC、FAS、GPAT基因表达均明显下调，SCD基因表达明显上调，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结论  SchB可能通过抑制内质网应激信号通路蛋白的表达，进而影响脂肪合成相关基因表达，从而降低肝脏TG的堆积。

关键词：五味子乙素;非酒精性脂肪肝病;细胞模型;内质网应激;L02细胞株

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）12-0045-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.011  开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Schisandrin B on Hepatic Lipid Accumulation， Endoplasmic Reticulum Stress Signaling Pathway Protein and Expressions of Fatty Acid Synthesis-related Genes in Nonalcoholic Fatty Liver Disease Cell Model

YU Jie^1，2， DONG Yanmin³， WANG Hui²， WANG Yulin¹

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2. Beijing City University， Beijing 100083， China; 3. Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China

Abstract： Objective To observe the effects of Schisandrin B （SchB） on hepatic lipid accumulation， endoplasmic reticulum stress signaling pathway and expressions of fatty acid synthesis-related genes in nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）; To explore the mechanism of action of lipid lowering. Methods NAFLD cell model was induced by incubating a normal human hepatocytes-derived cell line L02 with 1 mmol/L free fatty acids mixture （oleate and palmitate， 2：1） for 24 hours. This model then was treated with different concentrations of SchB， and the cellular total lipid accumulation was determined by flow cytometry. Intracellular triglyceride （TG） contents were measured. Endoplasmic reticulum stress signaling pathway-associated proteins Bip， SREBP-1， PERK， p-PERK， and p-eIF2α were detected by Western blot. Fatty acid synthesis of stearoyl-CoA desaturase （SCD）， glycerin-3-phosphate acyltransferase （GPAT）， acetyl CoA carboxylas （ACC） and fatty acid synthase （FAS） were detected by RT-PCR. Results The L02 cell fat accumulation model was successfully established in vitro. Compared with the model group， the lipid accumulation in the SchB group significantly decreased （P<0.05）， and SchB could decrease the TG level in a dose-dependent manner， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）; Compared with the control group， the expressions of Bip， SREBP-1， p-PERK， p-eIF2α protein and ACC， FAS and GPAT genes were up-regulated， and the expression of SCD gene was down-regulated; Compared with the model group， the expressions of endoplasmic reticulum stress signal pathway protein and ACC， FAS and GPAT genes in SchB concentration groups were significantly down-regulated， and the expression of SCD gene was up-regulated， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. Conclusion SchB may inhibit the accumulation of liver TG by inhibiting the expressions of endoplasmic reticulum stress signaling pathway proteins， thereby affecting the expressions of genes involved in fat synthesis.

Keywords：Schisandrin B; nonalcoholic fatty liver disease; cell model; endoplasmic reticulum stress; cell line L02

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种常见肝病，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变和脂肪蓄积为病理特征。近年来，NAFLD在我国发病率大幅提高，我国成年人NAFLD发病率达12%～15%^[1]。迄今临床尚无批准的治疗NAFLD的特效药物，因此相关药物研究已成为热点。五味子乙素（Schisandrin B，SchB）是五味子中主要的木脂素类活性成分，前期研究发现，五味子乙素对NAFLD小鼠具有治疗作用^[2]。有研究显示，肝脂质堆积与内质网应激信号通路具有相关性^[3]，为进一步探究SchB的药理作用，本研究以游离脂肪酸（FFA）共培养人胚胎肝细胞L02，诱导体外NAFLD细胞模型。通过流式细胞技术、组织细胞酶法评价SchB对肝脂质堆积和三酰甘油（TG）含量的影响，采用Western blot和RT-PCR分别检测与NAFLD发病相关的内质网应激信号通路相关蛋白和FFA合成相关基因的表达，探讨SchB降脂的作用机制。

1  材料与方法

1.1  细胞株

人胚胎肝细胞L02细胞株，购自中国科学院细胞库。

1.2  药物与试剂

SchB，成都普瑞法公司，批号130620。油酸、软脂酸、尼罗红、二甲基亚砜、牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司;DMEM培养基、0.25%胰酶溶液，美国GIBCO公司;胎牛血清（FBS）、0.1 mol/L PBS，美国Hyclone公司;BCA法蛋白质定量检测试剂盒、RIPA蛋白裂解液和ECL发光试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司;TG酶法测定试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司;Trizol试剂，Invitrogen公司;GoScript反转录试剂盒，Promega公司;蛋白酶抑制剂，Pierce公司;磷酸酶抑制剂，Roche公司;兔抗人SREBP-1抗體、PERK抗体、Bip抗体、p-eIF2α抗体和辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG，Cell Signaling公司;NC膜，PALL公司;其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3  主要仪器

Varioskan flash全波长扫描式多功能酶标仪（美国Thermo Scientific），NanoDrop2000紫外微量分光光度计（美国Thermo Scientific），EPICS-XL型流式细胞仪（美国Beckman-Coulter），电泳转印系统（上海天能科技有限公司﹚，PCR仪（美国Bio-Rad），垂直电泳系统MINI-PROTEAN 3（美国Bio-Rad），BYCp-31D电泳槽（北京市六一仪器厂），凝胶成像系统（美国UVP）。

1.4  细胞培养及给药

将L02细胞用含10%胎牛血清DMEM于37 ℃、5%CO₂培养箱培养，传代。于6孔板中加入L02细胞，培养至融合80%，加入含有1%BSA、1 mmol/L的FFA混合物（油酸∶软脂酸=2∶1）的DMEM培养基，构建脂肪肝细胞模型。同时设置对照组、模型组和给药组（1、5、10、50 μmol/L SchB组），对照组加2 mL DMEM，其他组加含FFA的DMEM培养基2 mL，其中给药组分别加入1、5、10、50 mmol/L SchB贮存液（SchB粉末溶于二甲基亚砜配制）2 μL，于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养24 h，进行指标测定。每组设4个复孔，分别用于检测脂质堆积、TG含量、内质网应激信号通路蛋白及脂肪酸合成相关基因，实验重复3次。

1.5  流式细胞仪测定L02细胞脂肪堆积

上述培养的细胞进行胰酶消化，1000 r/min离心5 min，收集细胞，预冷PBS洗涤2次×10 min，重悬于1 μmol/L尼罗红染液1 mL，室温避光振荡染色30 min。随后以预冷PBS洗涤2次，重悬于500 μL PBS，流式细胞仪490 nm excitation/570 nm emission随机计数10 000个细胞，检测其荧光强度，各处理组荧光强度与对照组比较，计算倍数变化。

1.6  三酰甘油含量检测

上述培养的细胞分别进行胰酶消化，200×g离心5 min，收集细胞，分别取约1×10⁶个细胞。参照组织细胞酶法测定试剂盒说明书方法测定TG含量，参考BCA法蛋白定量检测试剂盒说明书测定细胞蛋白浓度，TG含量表示为μmol/L/μg蛋白，各处理组TG含量与对照组比较，计算倍数变化。

1.7  Western blot检测内质网应激信号通路相关蛋白的表达

胰酶消化上述培养的细胞，以RIPA裂解液裂解细胞并收集蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，每孔上样50 μg蛋白，随后，电转移至硝酸纤维素（NC）膜，以含5%脱脂奶的TBST缓冲液37 ℃封闭30 min，分别加入1∶1000稀释的相应一抗，4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，漂洗3次。在NC膜上滴加ECL发光液，暗室压片、显影。

1.8  RT-PCR检测脂肪酸合成相关基因的表达

收集上述培养的细胞，加1 mL Trizol，按说明书流程提取RNA，以Nanodrop分光光度计测定RNA浓度。随后使用Promega反转录试剂盒，按照试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，然后，按20 μL体系[2×PCR buffer 10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL（見表1）、ddH₂O 7 μL]进行PCR扩增，操作步骤：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，47 ℃、0 s（β-actin），57 ℃、30 s（ACC），61 ℃、30 s（FAS），55 ℃、30 s（GPAT），55 ℃、30 s（SCD），72 ℃、30 s，30个循环;72 ℃、10 min。1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，紫外透视分光仪观察。

1.9  统计学方法

采用GraphPad Prism 5 Demo软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，组间比较采用student-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  五味子乙素对L02细胞肝脂肪堆积的影响

尼罗红是一种亲脂性恶嗪类荧光染料，可与FFA、磷脂和胆固醇特异性结合，在543 nm激发光激发下，显示桔红色荧光，用流式细胞仪检测的尼罗红荧光强度，与细胞内脂质含量成正比。FFA与L02细胞共培养24 h后，脂质堆积明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，SchB各浓度组L02细胞脂质均减少，1、10 μmol/L SchB组差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图1。

2.2  五味子乙素对L02细胞三酰甘油含量的影响

与对照组比较，模型组L02细胞TG含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，SchB各浓度组L02细胞TG含量均降低，除1 μmol/L SchB组外差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01），呈剂量依赖性。结果见图2。

2.3  五味子乙素对L02细胞内质网应激信号通路蛋白表达的影响

模型组内质网应激信号通路活化关键蛋白Bip表达增加，给予SchB后，随着SchB浓度增加，Bip表达量下降，呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，SchB各浓度组L02细胞p-PERK、p-eIF2α、SREBP-1表达降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见图3、表2。

2.4  五味子乙素对L02细胞脂肪酸合成相关基因表达的影响

与对照组比较，模型组L02细胞ACC、GPAT和FAS表达升高、SCD表达降低（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，SchB各浓度组L02细胞ACC、GPAT和FAS表达降低，SCD表达上调，除1 μmol/L SchB组外差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。

3  讨论

NAFLD是目前常见的肝脏疾病，由于肝细胞内脂肪堆积，导致肝脏脂肪变性，引起肝脏代谢功能异常，并引起一系列疾病^[4]。目前常用的NAFLD治疗主要有保护肝细胞药、抗氧化剂及降脂药。SchB具有保护肝脏、降低转氨酶、修复受损的肝细胞的作用^[5]。王昌等^[6]筛选了五味子木质素类中护肝的主成分，分别以五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲等成分作用于受损的L02细胞，结果表明SchB的护肝作用最强。蔡晶等^[7]发现SchB可减轻H₂O₂导致的细胞氧化损伤，且这种保护作用随SchB剂量的升高而增强。为验证SchB的降脂效果，我们采用FFA作用L02细胞，建立NAFLD细胞模型，给予SchB后，采用流式细胞仪分析脂质含量并进行TG检测，验证SchB降低脂类堆积的能力。结果显示，与模型组比较，SchB干预后肝细胞内脂质含量降低，但未呈剂量依赖。结合前期动物实验结果，SchB对胆固醇无明显作用。因尼罗红可同时与TG和胆固醇结合，细胞内脂质检测存在胆固醇干扰，可能导致SchB对细胞内脂质的影响无剂量依赖性。后续实验进一步检测其对TG含量的影响，发现SchB可剂量依赖性降低肝细胞TG含量，说明其主要通过降低TG含量发挥降脂作用。

有研究显示，内质网应激与NAFLD发病机制相关^[8]。内质网是真核细胞内重要的细胞器，是脂肪酸代谢的第一场所。内质网应激触发的非折叠蛋白反应（UPR）由3种内质网固有分子介导：Ⅰ型内质网转膜激酶（IRE-Ⅰ）、活性转录因子6（ATF-6）和PKR样内质网激酶（PERK）。非应激情况下，这3种蛋白均与葡萄糖调节蛋白78（Grp78/Bip）结合形成复合体，处于无活性状态。应激发生时，内质网内未折叠蛋白增多，与Bip竞争性结合，IRE-Ⅰ、ATF-6和PERK与Bip解离，随即活化下游转录因子及UPR靶分子等基因转录。PERK活化后可磷酸化真核翻译起始因子eIF2α，继而活化固醇调节元件结合蛋白SREBP-1，活化的SREBP-1进入核内启动与脂肪酸和TG合成有关基因ACC、FAS、低密度脂蛋白受体LDLR等的转录，从而增加肝脏脂肪酸的合成和积聚^[9-10]。本研究结果显示，模型组L02细胞Bip、SREBP-1、p-eIF2α均升高，且下游基因ACC、FAS、GPAT表达升高，SCD表达降低，而加入SchB后呈相反的结果，提示SchB可通过抑制内质网应激信号通路治疗NAFLD。

综上，在NAFLD细胞模型中，内质网应激信号通路被激活，而SchB干预可剂量依赖性抑制该信号通路，进而影响脂肪合成相关基因表达，从而降低脂質堆积。本研究可为进一步探讨SchB治疗脂肪肝的机理和临床治疗NAFLD新药的研发提供依据。

参考文献：

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（收稿日期：2019-07-18）

（修回日期：2019-08-01;编辑：华强）