气相色谱法测定化合物中R-氯甘油的含量

2019-12-30李春刚唐祁匀

分析测试技术与仪器 2019年4期

高衎，周洁，李春刚，唐祁匀

(上海现代制药海门有限公司，江苏南通 226100)

R-氯甘油是一种氯代醇，具有基因毒性示警结构[1](如图1所示)，是碳链中带有一个或几个氯原子和一个或几个羟基的有机化合物.R-氯甘油常温下呈液态，纯品无色，易溶于水，作为化工产品原料和杀菌剂极为广泛的应用于人们的生产和生活中. 2011 年国际癌症研究机构将其归为 B组可能致癌物[2]. 作为一种基因毒性杂质，极低浓度的氯甘油即可损伤脱氧核糖核酸(DNA)[3-4]，严重威胁了患者的生命安全. 近年来，基因毒性杂质的研究与控制在药品质量研究领域占据核心地位. 因此，在一些化合物的加工、生产过程中，R-氯甘油无论作为起始原料亦或是最终产物，其含量的准确测定都十分关键.

图1 R-氯甘油结构图Fig. 1 Structure of (R )-(-)-3-Chloro-1,2-Propanediol

当前，化工企业对R-氯甘油的质量研究比较简单且没有统一的标准. 文献也鲜有报道相关的测定方法. 一些有条件的企业分别通过离子色谱法和ICP-MS法来测定氯离子或氯元素的量，从而间接反映R-氯甘油的含量. 不过，这些方法专属性较差，并且操作复杂，难以得到推广. 参考其他氯代醇及类似结构化合物的分析方法，本文拟采用气相色谱法[5-7]、气相色谱-质谱法[8]对其进行研究. 本文通过对色谱柱、检测器的筛选及色谱参数的优化，建立了定量测定产品中R-氯甘油含量的气相色谱法. 该方法经济、实用，具有很高的应用价值.

1 仪器与试剂

安捷伦e7890型气相色谱仪(美国Angilent公司)；Empower色谱工作站(美国waters公司)；梅特勒ML240型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；色谱柱Aglient HP-FFAP(30 m×0.53 mm×0.25 μm，美国Angilent公司).

R-氯甘油标准品(北京百灵威，LP80R12批，纯度为99.0%)；化合物A对照品(自制，HM12-18060601批，纯度为99.5%)；甲醇(德国默克，10951907818批，色谱级)

2 试验部分

2.1 溶液配制

2.1.1 供试品溶液的配制

取化合物A对照品约250 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使完全溶解，冷却，用甲醇定容，摇匀即得.

2.1.2R-氯甘油标准溶液的配制

取R-氯甘油标准品约250 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使完全溶解，冷却，用甲醇定容，摇匀，作为R-氯甘油标准储备液. 分别精密移取R-氯甘油标准储备液1.6、2.0、2.4、3.0、4.0 mL，置于不同的100 mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀即得.

2.1.3 回收率溶液的配制

取化合物A对照品约500 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，平行称取9份，分别加入R-氯甘油标准储备液0.8、1.0、1.2 mL，每个浓度水平配制3份，用甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀即得.

2.1.4 重复性溶液的配制

精密量取R-氯甘油标准储备液5.0 mL,置于250 mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，作为加标稀释液. 取化合物A对照品约250 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，用上述加标稀释液溶解并稀释到刻度，摇匀即得. 平行配制6份.

2.2 色谱条件

色谱柱:以硝基对苯二酸改性的聚乙二醇为固定液的毛细管柱,起始温度为75 ℃，维持3 min，以20 ℃/min的速率升至150 ℃，再以8 ℃/min的速率升至180 ℃，然后以30 ℃/min的速率升至240 ℃，维持12.5 min. 进样口温度280 ℃，分流比1∶1；检测器(FID)温度为290 ℃；流速为5 mL/min.

2.3 方法验证

2.3.1 专属性

取配制的供试品溶液、R-氯甘油标准溶液及空白溶剂甲醇各2 μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图.

2.3.2 定量限、检测限

取配制的R-氯甘油标准溶液，逐步稀释，使S/N约为10，记录此时的浓度为定量限. 继续稀释，使S/N约为3，记录此时的浓度为检测限.

2.3.3 线性试验

取5种不同浓度的R-氯甘油标准溶液各2 μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图. 按选定的的方法进行测定. 以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制R-氯甘油标准曲线，计算回归方程.

2.3.4 进样精密度试验

取“R-氯甘油标准溶液(100 μg/mL)，连续进样6次，考察峰面积的RSD.

2.3.5 重复性

取供试品(HM12-1860601批)适量，以R-氯甘油标准溶液(100 μg/mL)作为对照溶液，按外标法计算，考察R-氯甘油含量的RSD.

2.3.6 加样回收率试验

取回收率溶液各2 μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图. 按外标法计算回收率溶液中R-氯甘油的含量.

回收率=(测得量-本底量)/加入量×100%

(1)

3 试验结果与讨论

3.1 专属性

试验结果表明，空白溶剂及供试品均不干扰测定，R-氯甘油峰与供试品中其它残留溶剂峰分离度大于2.0，方法专属性良好. 试验结果如图2所示.

图2 R-氯甘油标准色谱图Fig. 2 Standard chromatogram of (R )-(-)-3-Chloro-1,2-Propanediol

3.2 检测限、定量限

试验结果表明，R-氯甘油检测限为2.06 ng，定量限为6.58 ng，如表1所列.

表1 定量限与检测限结果Table 1 Results of LOD and LOQ

3.3 线性关系

试验结果表明，在80～200 μg/ml范围内，R-氯甘油浓度与峰面积的线性关系良好，线性方程为y=2.558 8x-62.469，r=0.999 4.

3.4 进样精密度

试验结果表明，R-氯甘油峰面积的RSD低于1.0%，进样精密度良好，如表2所列.

3.5 重复性

试验结果表明，R-氯甘油含量的RSD低于2.0%，方法重复性良好，如表3所列.

3.6 回收率

试验结果表明，不同浓度水平的样品回收率均在98%～102%范围内，相对标准偏差均低于5.0%，如表4所列. 由表4可见，本方法准确度良好，满足定量测定的要求.

表2 进样精密度试验结果Table 2 Results of injection precision

表3 重复性试验结果Table 3 Results of repetitive test

表4 回收率试验结果

3.7 讨论

R-氯甘油作为一种基因毒性杂质，控制限度极低，单一气相色谱很难达到要求，往往需要结合GC-MS进行后续研究. 本文为R-氯甘油的GC-MS测定方法研究提供了一定的基础，也能够帮助企业初步判断R-氯甘油的含量，节省检验成本. 采用GC-MS测定时，由于灵敏度增加，可在本方法基础上适当增大分流比，以获得更好的重现性. 同时，氯甘油有R型和S型两种构象，通常情况下，市售多为混合型. 这两种构型的理化性质极为相似，因此，本方法对R-氯甘油异构体[9]的测定也具有较高的参考价值.