盐碱土壤中微生物菌株的分离、筛选与功能评价

武芳 李勇 路兆军

摘 要：通过对盐碱土壤中微生物菌株的分离、筛选和功能评价，结果表明，菌株DY23具有较好的耐盐碱能力，在培养基的NaCl浓度达到20%且pH值为12.0的条件下仍可生长;对棉枯萎病、黄瓜枯萎病、小麦纹枯病和烟草赤星病均具有生防作用;具有较好的溶磷能力;可分泌生长素IAA，对小白菜有较好的促生作用;经16SrRNA序列的测序结果与NCBI数据库的比对，显示其为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）。

关键词：盐碱;分离;筛选;功能评价;阿氏芽孢杆菌

中图分类号 S156.4文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）23-0024-05

Isolation，Screening and Functional Evaluation of Microbial Strains in Saline Alkali Soil

Wu Fang1 et al.

（1Yantai Diyuan Biotechnology Co.，Ltd.，Yantai 264003，China）

Abstract：Through isolation，screening and functional evaluation of microbial strains in saline-alkali soil，it was found that strain DY23 had good salt-alkali tolerance，and could grow when NaCl concentration reached 20% and pH value was 12.0;it had biocontrol effects on Cotton Fusarium wilt，Cucumber Fusarium wilt，Wheat Sheath Blight and tobacco brown spot;it had good phosphorus-soluble ability;It secretes auxin IAA;It also has a good growth promoting effect on Chinese cabbage. By comparing the 16S rRNA sequence with NCBI database，it was shown that it was Bacillus aryabhattai.

Key words：Saline-alkali;Isolation;Screen;Functional evaluation;Bacillus aryabhattai

近年来，随着土地盐碱化的日益加剧，对农业生产和生态环境的影响越来越严重。从世界范围来看，约有20%的耕地和接近50%的灌溉农田产量严重受到高浓度盐碱土壤的影响。在中国，约有670万hm2的次生盐渍化农田，占耕地总面积的10%。如何减轻盐碱土壤对农业产量的影响、更好地利用盐碱地，提高农林业生产的经济、社会和生态效益，是现代农林业所关注的重大问题之一[1]。在国内外盐碱地改良研究领域，先后提出了“种稻改碱”[2]农业改良措施，“灌水洗盐”[3]工程改良措施，以及利用石膏、氯化钙、工业废酸、燃煤烟气脱硫物等化学改良措施。这些措施见效快，取得了显著的成果，但与此同时，也存在改良成本高，资源耗费大，且产生了养分流失、污染下游、改良效果不稳定、容易返盐等问题。

随着对盐碱土壤的不断研究，并结合环保改良理念，人们开始从恢复生态的角度将盐碱地的改良和利用结合起来，即“寓改良到利用中，改良与利用并行”，发现以生物利用为核心的生态恢复技术是未来盐碱地改良修复的突破口。目前，生物改良包括种植耐盐碱植物、使用微生物菌肥等。而开发高效的微生物菌肥制剂，首先要获得在高盐条件下能够促进植物生长的微生物菌株。本研究通过针对性的采取样品，并经过分离、筛选及功能评价等措施，得到了1株在高盐碱环境下具有促生和防病潜力的菌株，经鉴定为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），为加速以生物利用为核心的生态修复技术的应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品  本研究的样品共2份，1份于2009年10月采自四川泸州白酒生产厂的中层窑泥，编号为1号;另1份于2009年8月采自天津静海地区玉米地的表层土壤，编号为2号。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 Gibbons改良培养基[4] 干酪素5.0g，柠檬酸钠3.0g，酵母浸粉10.0g，KCl2.0g，蛋白胨5.0g，MgSO4·7H2O2.0g，NaCl100g，pH值9.0[5]。固体培养基需每1000mL加20g琼脂。

1.1.2.2  蒙金娜有机培养基[6]  Glucose 10g，（NH4）2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O0.03g，SO4Mn 4H2O0.03g，Lecithin（卵磷脂）0.2g，Yeast extract paste 0.4g，Agar 20g，蒸馏水补足至1000mL，pH7.0～7.5。

1.1.2.3  PKO无机培养基[6]  Ca3（PO4）23.0g，Sucrose 10g，（NH4）2SO4 0.5g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.3g，FeSO4 0.002g，MnSO4 0.004g，Yeast extract paste 0.5g，Agar 15g，蒸餾水补足至1000mL，pH 6.8～7.2。

1.1.2.4  亚历山大罗夫培养基[7]  蔗糖5g，Na2HPO4 2g，MgSO4.·7H2O 0.5g，FeCl3 0.005g，CaCO3 0.1g，土壤矿物1g，琼脂20g，pH 7.0～7.5。

1.1.2.5  CCM液体培养基[8]  甘露醇5.0g，蔗糖5.0g，乳酸0.5mL，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，CaCl2·2H2O 0.06g，NaCl 0.1g，NaMoO4·2H2O 2.5mg，酵母粉0.1g，Fe-EDTA 4mL（1.64%），NH4NO3 1g，色氨酸0.1g，pH值7.0。

1.1.2.6  保存培养基  牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，加蒸馏水配成1000mL，pH值调至7.2～7.4，121℃灭菌20min倒斜面备用。

1.1.3 供试植物和土壤  试验植物为小白菜，盆栽土壤选取山东陵县盐碱地未改良土。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离纯化  首先，将土壤样品进行风干处理，而后分别称取10g，磨碎后加入到装有90mL0.9%的无菌生理盐水和少量玻璃珠的三角瓶中，200r振荡20min后，进行梯度稀释。取0.1mL经适当稀释后梯度的样品涂布于Gibbons改良培养基平板上。置于30℃培养箱中培养8d。待长出单菌落后，挑取单一菌落进行划线培养，并通过反复平板划线得到纯菌株。然后将纯菌株接种到斜面培养基上，于30℃下恒温培养4d后，放入4℃冰箱保存备用。

1.2.2 耐盐碱微生物菌株的筛选及盐碱耐受力的测定 通过不断分别提高Gibbons改良培养基的盐度和碱度，来进行耐盐碱微生物菌株的筛选。首先使Gibbons改良培养基pH值保持为9.0，逐次将培养基的盐度提高2%，使NaCl浓度分别为10%、12%、14%、16%、18%和20%;然后再将Gibbons改良培养基盐度的NaCl浓度保持10%不变，每次将培养基的pH值提高1个单位，即pH值分别为8、9、10、11和12。将斜面培养基上保存的菌株接种到上述平板上，置于30℃环境下培养8d，以菌株是否可以长出来作为评判菌株是否耐盐碱的标准，从而筛选出具有耐盐碱能力的菌株。

1.2.3 耐盐碱微生物菌株的生防作用评价 采用平板对峙法，评价部分功能菌株对棉花枯萎病、黄瓜枯萎病、小麦纹枯病、烟草赤星病等4种病原菌的拮抗能力。将筛选得到的6株耐盐碱能力较好的菌株与4种病原菌在PDA平板上作对峙培养，平板中央接种新鲜的病原菌，在距离平板边缘1cm处用接种环涂直径为0.5cm的细菌菌斑，28℃恒温培养3～5d后，观察各个菌株对病原菌拮抗作用的有无。

1.2.4 耐盐碱微生物菌株溶磷、解钾能力评价 利用菌株自身产生有机酸，经渗透扩散将其周围的有机或无机磷溶解从而形成1个透明的环。采用有机磷（蛋黄卵磷脂）和无机磷（Ca3（PO4）2）固体培养基溶磷圈法进行功能菌株溶磷能力的测定，每个供试菌株分别点接于蒙金娜有机磷和PKO无机磷培养基培养，每培养皿3个接菌点，每菌3个重复，置生化培养箱28℃下恒温培养，每天测量菌落直径和溶磷透明圈直径，至其无明显变化止。每个菌种分别点接于亚历山大罗夫培养基，每个培养皿3个接菌点，每株菌3个重复，置生化培养箱28℃下恒温培养，每天测量菌落直径和解钾透明圈直徑，至其无明显变化。

1.2.5 耐盐碱微生物菌株促生能力评价 植物生长激素（IAA）对作物的生长、产量及品质、均有较大的影响。采用Salkowski比色法[9-11]测定细菌分泌植物生长激素（IAA），将供试菌株接种CCM液体培养基（培养基中需加入色氨酸）的三角瓶中，每瓶盛有50mL培养基，每菌株重复3次，置于28℃摇床，180r震荡培养4d。取100μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加100μLSalkowski比色液（50mL 35%HClO4和1mL0.5M FeCl3混合）。对照只在比色液中加入50μL50mg/L的IAA。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA。

1.2.6 盆栽效果评价试验

1.2.6.1  耐盐碱微生物菌株菌液的制备  菌液的制备方法为于-70℃冰箱中取出原始菌株，在LB平板上划线，28℃下培养24h，待长出单菌落，挑取其接入含有5mL LB培养液的试管中，28℃，200r培养24h，制成种子液;以1%的接种量将种子液接种于装有500mL LB培养液的1L规格的大三角瓶里，28℃，200r培养22～24h，以得到浓度为1～10×108cfu/mL的菌液。

1.2.6.2  盆栽效果评价实验  选用30cm栽培盆，生长速度快的小白菜作为供试作物，土壤选取山东陵县盐碱地未改良土，共设置8个处理，分别为：（1）清水对照，（2）培养基对照，（3）DY07菌液，（4）DY08菌液，（5）DY12菌液，（6）DY19菌液，（7）DY23菌液，（8）DY24菌液。每个处理24棵苗，每盆1棵苗。待小白菜长出2片真叶时，浓度为1×108CFU/mL的菌液缓慢灌入小白菜苗根围，每株20mL，随后置于温室中培养，28℃，70%相对湿度以上，16/8h光周期，观察小白菜生长情况。生长15d后对小白菜的株高、根长和鲜重进行测量，求出平均值。

1.2.7 菌株鉴定 鉴定方法为16S rRNA基因片段序列测序。采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16S rDNA扩增通用引物U8-27、L1494-1514从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。

引物：U8-27（F）5'-AAGTTTGA TC（AC）TGGCT-AG-3';

L1494-1514（R）5'-CTACGG（AG）TACCTTGTTAC-AC-3'

反应体系：10×PCR Buffer ………………… 2.5μL

Mg2+ …………………………… 3.75μL

dNTP ……………………………2μL

引物P1/P2 ………………………0.6μL

模板DNA …………………………1μL

rTaq 酶 ………………………… 0.5μL

加超纯水至 ………………………25μL

反应参数：[94°C …… 5min94°C …… 1min56°C …… 1min72°C …… 2min72°C …… 10min12°C …… forever30 cycles]

PCR产物用1%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压120V，15min，EB染色20min，用凝胶回收试剂盒回收所需条带。将目标片段连接至载体pMD19-T，然后转入大肠杆菌（Escherichia coli）Top-10感受态细胞中，挑取单克隆，摇菌，测序。获得的16S rDNA序列在Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）进行比对，获得鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 耐盐微生物菌株的盐碱耐受力 以四川泸州白酒生产厂的中层窑泥样品样本和天津静海地区玉米地表层土壤样本为来源，在Gibbons改良培养基上分离得出50株菌株，并通过盐碱耐受力筛选得到6株具有耐盐碱的菌株，其中菌株DY23的耐盐能力最好，在NaCl浓度为20%的培养基上即可长出;而菌株DY24的耐碱能力最强，在pH值为12.0的培养基上即可长出（如表1和表2）。同时，提高Gibbons改良培养基的盐（NaCl）浓度和碱浓度（pH值），以菌株是否长出来比较各菌株的同时耐盐、碱能力。结果显示，只有1株同时既耐盐又耐碱的菌株DY23，当培养基的NaCl浓度达到20%且pH值为12.0的条件下仍可生长（如表3）。

2.2 耐盐微生物菌株的生防作用 通过平板对峙法，发现筛选出的耐盐碱菌株表现出了不同程度的拮抗作用，其中菌株DY07对棉枯萎病、黄瓜枯萎病和烟草赤星病有拮抗作用，菌株DY08和DY19对棉枯萎病菌和烟草赤星病有拮抗作用，菌株DY12只对棉枯萎病有拮抗作用，而菌株DY23和菌株DY24对4种病原菌均表现出拮抗作用（如表4）。

2.3 耐盐碱微生物菌株溶磷、解钾能力 通过在蒙金娜有机磷和PKO无机磷培养基培养上的测定，发现菌株DY07、DY08、DY19、DY23和DY24均有不同程度的溶磷能力，其中菌株DY08和DY23的溶磷能力最强;通过在亚历山大罗夫培养基上的检测，发现只有菌株DY12有解钾能力（如表5）。

2.4 耐盐碱微生物菌株促生能力 通过Salkowski比色法测定，发现菌株DY19、DY23和DY24可分泌IAA，其中菌株DY23分泌IAA的能力更强（如表6）。

2.5 盆栽效果 通过盆栽效果评价试验，发现施用菌剂的小白菜在株高、根长和鲜重方面指标都明显优于2个对照组，且培养基对照组和清水对照有不出苗和死苗的现象，其中DY23菌剂处理组的株高、根长和鲜重都明显优于其他处理组（如表7）

2.6 菌株测序结果 通过以上试验发现，菌株DY23有较好的耐盐碱能力，当培养基的NaCl浓度达到20%且pH值为12.0的条件下仍可生长;对棉枯萎病、黄瓜枯萎病、小麦纹枯病和烟草赤星病均有生防作用;具有较好的溶磷能力;可分泌生长素IAA，并对小白菜有较好的促生作用，故该菌在盐碱环境中可能有较好的促生和生防作用，經16S rRNA序列的测序结果与NCBI数据库的比对，显示其为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），相似度为98.9%（如表8）。

3 结论与讨论

科学家们根据微生物菌株的耐盐程度，提出了不同的耐盐性分类系统[12-17]，其中最常用的为Larsen等（1987）和Vreeland（1987）提出的分类系统。根据微生物菌株对NaCl的敏感程度，将其分为以下4大类：（1）非嗜盐微生物（nonhalophilic）：生长不需NaCl，低浓度的NaCl即会对其生长产生抑制作用;（2）轻度嗜盐微生物（slighthalophilic）：生长需少量NaCl，其生长最适NaCl浓度为1%～3%;（3）中度嗜盐微生物（moderately halophilic）：生长需少量NaCl，其生长最适NaCl浓度为5%～10%;（4）极端嗜盐微生物（extreme halophilic）：生长所需NaCl浓度为9%～32.5%，生长最适NaCl浓度为20%。再根据微生物菌株对碱的耐受力不同，也被分为了4类，分别为：（1）耐碱微生物（alkalotolerant microbes），pH值7～9生长，pH值>9.5不能生长;（2）嗜碱微生物（alkalophiles或称嗜碱生物），pH值10～12生长;（3）极端嗜碱微生物（extreme alkaliphile），最适生长pH值≥10，pH值低于8.9～9则不生长，为专性极端嗜碱微生物;（4）兼性嗜碱微生物（facultative alkaliphile），指该微生物具有能在2种或2种以上不同环境下生存和繁衍后代的能力，如其既可以在pH>7的环境中生存，也可在pH<7的环境中生存。而根据耐碱性微生物菌株对盐的耐受力，又可分为嗜碱菌和耐盐性嗜碱菌。嗜碱菌为可以在pH>9的环境生长，在pH=10时生长最为良好，不需要高浓度的盐环境。而耐盐性嗜碱菌则在pH>9、盐浓度为9%～32.5%的环境下也可生存[18]。由此可见，本研究中的阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）属于耐盐嗜碱微生物，具有较强的耐盐碱能力。

阿氏芽孢杆菌除可耐盐碱以外，在大分子降解、产物合成以及促进植物生长等方面也表现出突出作用，在一些国内外发明专利上，发表了阿氏芽孢杆菌在植物抗病害和促生长方面的作用。如李祖红[19]等研究发现，阿氏芽孢杆菌对防治烟草黑胫病有显著效果，且对人、畜、农作物无害;另有证明阿氏芽孢杆菌AB211[20]可溶解无机磷酸盐，合成铁载体，并能产生吲哚乙酸（IAA）等激素。但是对于阿氏芽孢杆菌在盐碱环境中既产生促生、又产生抗病的研究比较少，只有井大炜[21]等研究阿氏芽孢杆菌在重盐碱环境中可促进怪柳的生长，但并未提到其抗病作用。在现实环境中，高盐环境往往同时伴随着高碱性，所以本研究中提到的阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）可在盐碱环境中既起到促生又起到抗病的作用，具有更高的实际应用潜力。

参考文献

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（责编：张宏民）