IL-17在鼻息肉形成中的作用机制

董庆喆，李慎玲，连媛媛，徐禛，张念凯，姜晓丹

摘要：目的  檢测白介素-17（IL-17）及其受体（IL-17R）在鼻息肉和正常鼻黏膜中的表达及IL-17在鼻息肉患者血清中的表达，观察IL-17 在鼻息肉发病过程中可能的作用机制和意义。方法  鼻息肉组织及血清标本来自青岛大学附属医院耳鼻咽喉科2016年11月～2017年11月行鼻息肉切除术的42例患者，选取10例同期行上颌窦囊肿手术切除的正常中鼻道黏膜组织作为正常鼻粘膜对照，10例健康成年人血清作为正常对照。HE 染色用于常规组织病理学检查，免疫组织化学染色观察IL-17及其受体表达水平及部位，双重免疫组织化学染色观察表达IL-17的细胞，ELISA法检测血清中IL-17蛋白表达水平。结果  ①42例鼻息肉组织中IL-17和IL-17R阳性细胞数较正常鼻黏膜组织中多，差异有统计学意义（P<0.05）;巨噬细胞表面标志（CD68）在鼻息肉组织中的表达比正常鼻黏膜组织高，差异有统计学意义（P<0.05）。②IL-17及CD68双重免疫组化染色显示IL-17主要表达于鼻息肉巨噬细胞上，IL-17R主要表达于上皮层基底细胞、腺管基底细胞及血管内皮细胞。③42例鼻息肉患者血清中IL-17蛋白水平和健康成年人比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论  IL-17对鼻息肉的形成作用可能是通过影响巨噬细胞的功能及相关细胞因子实现的，IL-17与IL-17受体的相互作用可能参与鼻息肉的病理改变，如上皮细胞基底膜增厚及腺体增生等。

关键词：鼻息肉;白介素-17受体;巨噬细胞

中图分类号：R765.25                                文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.22.019

文章编号：1006-1959（2019）22-0059-04

The Mechanism of Action of IL-17 in the Formation of Nasal Polyps

DONG Qing-zhe1，LI Shen-ling2，LIAN Yuan-yuan2，XU Zhen2，ZHANG Nian-kai2，JIANG Xiao-dan2

（Department of Biological Specimen1，Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery2，

Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，Shandong，China）

Abstract：Objective  To detect the expression of interleukin-17 （IL-17） and its receptor （IL-17R） in nasal polyps and normal nasal mucosa and the expression of IL-17 in serum of patients with nasal polyps， and to observe the incidence of IL-17 in nasal polyps. Possible mechanisms and implications of the process. Methods  Nasal polyps and serum samples were obtained from 42 patients with ENT， from November 2016 to November 2017 in the Department of Otorhinolaryngology， Affiliated Hospital of Qingdao University. Ten normal nasal mucosa were removed from the maxillary sinus cyst. Tissue was used as a normal nasal mucosa control and 10 healthy adult sera were used as normal controls. HE staining was used for routine histopathological examination. The expression level and location of IL-17 and its receptor were observed by immunohistochemical staining. The cells expressing IL-17 were observed by double immunohistochemical staining. The serum IL-17 protein expression was detected by ELISA level.Results  ①The number of IL-17 and IL-17R positive cells in 42 cases of nasal polyps was higher than that in normal nasal mucosa，the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of macrophage surface marker （CD68） in nasal polyps was higher than that in normal nasal mucosa，the difference was statistically significant （P<0.05）.②IL-17 and CD68 double immunohistochemical staining showed that IL-17 was mainly expressed on nasal polyp macrophages， and IL-17R was mainly expressed in epithelial basal cells， glandular basal cells and vascular endothelial cells.③There was no significant difference in serum IL-17 protein levels between 42 patients with nasal polyps and healthy adults （P>0.05）. Conclusion  The formation of IL-17 on nasal polyps may be achieved by affecting the function of macrophages and related cytokines. The interaction of IL-17 with IL-17 receptor may be involved in the pathological changes of nasal polyps membrane thickening and glandular hyperplasia.

Key words：Nasal polyps;Interleukin-17 receptor;Macrophage

慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是一种常见病，发病率及复发率均较高，其致病机制至今尚未明确，目前普遍认为是多因素共同作用的结果，如感染性因素、嗜酸性粒细胞浸润及鼻变态反应等。近年来，Th17细胞被认为是一个独立的辅助T细胞亚群，以分泌IL-17A（亦称IL-17）为主要特征[1]。IL-17A是IL-17家族（IL-17A-F）的基础成员，是一种致炎细胞因子，可以促进T细胞的激活和刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞产生多种致炎因素，包括IL-1β、IL-6、IL-8、诱导性NO合酶、环氧化酶2、前列腺素E2[2]，而这些因子与鼻息肉的发病均有着密切的关系。IL-17在肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNAF6）参与下与IL-17受体结合，激活核因子κB（NFκB）和活化蛋白-1，进而调节促炎性细胞因子的活性[3]。基于此，本研究通过对鼻息肉组织中及鼻息肉患者血清中的IL-17进行检测，旨在探讨其在鼻息肉发病中的作用。

1材料与方法

1.1材料来源  鼻息肉组织标本来自青岛大学附属医院耳鼻咽喉科2016年11月～2017年11月行鼻息肉切除术的42例患者。其中男25 例，女17 例，年龄17～68岁，平均年龄（38.27±14.38）岁，均无过敏、支气管哮喘及阿司匹林耐受不良病史，术前2周无应用类固醇激素史。10例鼻黏膜对照组织来自同期因上颌窦囊肿行手术切除的正常中鼻道黏膜组织，其中男8例，女2例，年龄31～49岁，平均年龄（38.20±8.06）岁。鼻息肉患者血清标本来自上述42例鼻息肉患者，10例正常对照组血清来自同期我院体检中心的健康体检人员，其中男性6例，女性4例，年龄20～50岁，平均年龄（37.26±7.14）岁。本研究所有操作均取得研究對象同意，签署同意书，并经过青岛大学附属医院伦理委员会审批通过。

1.2试剂  兔抗人IL-17多克隆抗体来自Santa Cruz Biotech公司，羊抗人IL-17受体多克隆抗体来自R&D Systems Inc公司;鼠抗人CD68单克隆抗体购自福州迈新生物技术公司;人IL-17 ELISA 试剂盒（96孔板）购自Biosource 公司;双重免疫组化试剂盒、SP免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

1.3检测方法

1.3.1 SP免疫组化染色  所有组织标本以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，做4 μm 厚的连续切片。按照产品说明书采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶（SP）技术对标本进行常规免疫组化染色，一抗分别滴加IL-17多克隆抗体、IL-17受体多克隆抗体及CD68单克隆抗体。二氨基联苯（DAB）显色，Mayer 苏木素复染，封片。以胞浆或胞膜有棕黄色染色者为阳性细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.3.2双重免疫标记  选择10例 IL-17高表达的病例，用双重免疫标记方法确认 IL-17阳性表达的细胞类型。免疫组化步骤同前，但分2次滴加一抗，先滴CD68单克隆抗体，行碱性磷酸酶染色，阳性细胞胞质为蓝色。再滴加 IL-17多克隆抗体，行过氧化物酶染色，阳性细胞胞质为猩红色，同时表达CD68和IL-17的阳性细胞胞质为暗紫色。Mayer苏木素复染，封片。

1.3.3酶联免疫吸附试验  所有外周血静置30～60 min，3000 r/min，离心15 min，分离得血清，-80℃冻存。严格按照ELISA试剂盒产品说明书操作流程行血清中IL-17 蛋白水平检测，用ELISE检测仪测定OD值，根据标准曲线，计算出检测血清中IL-17蛋白浓度。

1.4结果判定  所有切片在光学显微镜下观察，IL-17、IL-17受体及CD68 阳性染色呈褐色，观察其在鼻息肉组织和对照组织中表达水平及部位。每个切片中随机选取10个高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，取各视野阳性细胞表达的平均数作为阳性细胞表达率。

1.5统计学处理  采用SPSS 22.0统计软件处理数据，使用（x±s）表示，比较行t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 IL-17表达比较  IL-17阳性反应呈棕褐色，主要存在于细胞浆。在鼻息肉组织中，IL-17 主要表达于较大的单个核细胞的细胞浆，少量表达于多形核细胞及浆细胞的细胞浆、棘细胞层上皮细胞，见图1。鼻息肉中IL-17阳性细胞数（6.33±1.98）个，较正常鼻黏膜组织中的（2.06±1.02）个多，见图2，差异有统计学意义（t=12.286，P<0.05）。

2.2 CD68 表达比较  CD68阳性反应呈褐色，主要存在于细胞浆，均为较大的单个核细胞，少数为多形核细胞，呈散在分布，见图3。鼻息肉组织中巨噬细胞（CD68）阳性细胞数为（5.36±1.34）个，较正常鼻黏膜组织中的（1.49±0.52）个多，见图4，差异有统计学意义（t=14.641，P<0.05）。双重免疫标记结果：CD68 及IL-17 同时标记于一种较大细胞的胞质中，呈暗紫色，此细胞为巨噬细胞，见图5。

2.3 IL-17R表达比较  IL-17R 阳性反应呈棕褐色，主要存在于细胞膜及细胞浆。在鼻息肉组织中，IL-17R主要表达于上皮层基底细胞膜、腺管基底细胞及小血管内皮细胞，见图6、图7。鼻息肉中IL-17R阳性细胞数为（11.34±2.33）个，较下鼻甲中的（2.52±0.77）个多，差异有统计学意义（t=20.352，P<0.05）。

2.4血清中IL-17 表达比较  42例鼻息肉患者血清中IL-17蛋白浓度为（84.74±11.47）pg/ml，与正常对照组的（87.27±9.65）pg/ml比较，差异无统计学意义（t=0.646，P>0.05）。

3讨论

鼻息肉是由复杂的多因素、多基因共同作用的结果，其本质是鼻黏膜的慢性炎性病变。嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞及上皮细胞均可参与激活、释放、诱导和调节多种细胞因子、生长因子等，通过多种方式调节炎性过程，导致鼻息肉形成[4]。

IL-17主要由活化的Th17细胞产生，Th17细胞近来被认为是一个独立的辅助T细胞亚群，以分泌IL-17为主要特征。Th17细胞在防御胞外微生物感染、介导慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用[1]。研究认为鼻息肉多数表达为Th2反应细胞因子（高水平IL-5）和嗜酸细胞标志物（嗜酸细胞阳离子蛋白-ECP、嗜酸细胞活化趋化因子-eotaxin）以及IgE的增高。随着对Th17细胞的深入研究[5]，Th1/Th2/Th17的免疫平衡机制在鼻息肉形成机制中的作用还有待深入研究。

鼻息肉是鼻黏膜的慢性炎症性疾病，组织学特征是大量的炎性细胞浸润，包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞等。上皮层和固有层的改变，例如杯状细胞增生、细胞外基质蛋白沉积、水肿、腺体增生和基底膜增厚[6]。IL-17是一种致炎细胞因子，可以促进T 细胞的激活和刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞产生多种致炎因素[2，3]，这些因子与鼻息肉的发病均有着密切的关系。IL-17在TNAF6参与下与IL-17受体结合，激活NFκB和活化蛋白-1，进而调节促炎性细胞因子的活性[3]。本研究结果发现IL-17主要表达于巨噬细胞，而巨噬细胞作为粘膜固有层内重要的免疫效应细胞，具有非特异性杀伤作用及抗原递呈作用，还可以合成和分泌多种细胞因子如白细胞介素1及6、肿瘤坏死因子（TNF）等[7]。本研究证实IL-17 主要表达于鼻息肉组织的巨噬细胞，且表达量较正常鼻黏膜组织明显增多，提示IL-17可能通過影响巨噬细胞的功能及相关细胞因子的作用，影响鼻息肉的免疫及炎症状态。此外，本研究结果显示，鼻息肉患者血清中IL-17蛋白水平与健康对照组基本一致，进一步说明IL-17 在鼻息肉的形成过程中发挥一种局部的免疫应答反应。而这种局部的免疫应答反应可能通过巨噬细胞及相关细胞因子实现的。另外，本研究还发现IL-17受体特异性强表达于上皮层基底细胞及腺管基底细胞，提示IL-17与IL-17R 的相互作用可能参与鼻息肉腺体增生和基底膜增厚等病理改变，从而促进鼻息肉的生长，亦提示Th17细胞可能参与鼻息肉的病理改变。

综上所述，IL-17及其受体与鼻息肉的发病有一定关系，IL-17可能通过影响巨噬细胞的功能及相关细胞因子的作用，影响鼻息肉的免疫及炎症状态。此外，IL-17与IL-17R 的相互作用可能参与鼻息肉的病理改变，如腺体增生及基底膜增厚，可能促进鼻息肉的发生发展。

参考文献：

[1]Moran EM，Mastaglia FL.The role of interleukin-17 in immune-mediated inflammatory myopathies and possible therapeutic implications[J].Neuromuscul Disord，2014，24（11）：943-952.

[2]Jaller Char JJ，Jaller JA，Waibel JS，et al.The Role of IL-17 in the Human Immune System and Its Blockage as a Treatment of Rheumatoid Arthritis， Ankylosing Spondylitis， and Psoriatic Arthritis[J].J Drugs Dermatol，2018，17（5）： 539-542.

[3]Xia W，Bai J，Wu X，et al.Interleukin-17A promotes MUC5AC expression and goblet cell hyperplasia in nasal polyps via the Act1-mediated pathway [J].PLoS One，2014，9（6）：e98915.

[4]Van Zele T，Holtappels G，Gevaert P，et al.Differences in initial immunoprofiles between recurrent and nonrecurrent chronic rhinosinusitis with nasal polyps[J].Am J Rhinol Allergy，2014，28（3）：192-198.

[5]Shaikh NS，Iyer JP，Munot YS，et al.Discovery and pharmacological evaluation of indole derivatives as potent and selective RORγt inverse agonist for multiple autoimmune conditions [J].Bioorg Med Chem Lett，2019，29（16）：2208-2217.

[6]Jiao J，Duan S，Meng N，et al.Role of IFN-γ， IL-13， and IL-17 on mucociliary differentiation of nasal epithelial cells in chronic rhinosinusitis with nasal polyps[J].Clin Exp Allergy，2016，46（3）：449-460.

[7]Bae JS，Kim JH，Kim EH，et al.The Role of IL-17 in a Lipopolysaccharide-Induced Rhinitis Model[J].Allergy Asthma Immunol Res，2017，9（2）：169-176.

收稿日期：2019-8-27;修回日期：2019-9-7

编辑/成森