RKIP在不同类型肺癌中表达的变化及临床意义

闫雪波，王炯

摘要：目的  觀察Raf激酶抑制蛋白（RKIP）在不同类型肺癌中表达的变化及探讨其临床价值。方法  选取鳞癌21例、腺癌23例及小细胞肺癌10例设为实验组，肺良性病变10例设为对照组，采用免疫组化的方法检测RKIP的表达，观察在不同类型肺癌中表达的差异及与临床分期的关系。结果  与对照组比较，实验组中RKIP的表达水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。实验组中RKIP的表达最低的是小细胞癌，其次为鳞癌，再次腺癌。对腺癌进一步研究发现，与Ⅰ及Ⅱ期比较，RKIP在Ⅲ及Ⅳ期的表达更低;与Ⅰ期比较，RKIP在Ⅱ期中表达稍有减低，但差异无统计学意义（P>0.05）;与Ⅲ期比较，RKIP在Ⅳ期中表达稍有减低，但差异无统计学意义（P>0.05）。磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达趋势与RKIP相反，与Ⅰ和Ⅱ期比较，在Ⅲ和Ⅳ期中表达明显升高。相关性分析显示，RKIP与p-ERK1/2的表达呈负相关（r=-0.893，P<0.05）。结论  RKIP表达水平的缺失可能促进了ERK1/2的磷酸化，从而促进了肺癌的发生及发展，因此检测RKIP的表达水平可能对诊断肺癌及分期预后有重要的临床价值。

关键词：RKIP;ERK1/2;肺癌;腺癌;癌症分期

中图分类号：R734.2                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.22.018

文章编号：1006-1959（2019）22-0055-04

Changes of RKIP Expression in Different Types of Lung Cancer and Its Clinical Significance

YAN Xue-bo，WANG Jiong

（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，

Hefei 230022，Anhui，China）

Abstract：Objective  To observe the changes of expression of Raf kinase inhibitory protein （RKIP） in different types of lung cancer and to explore its clinical value. Methods  21 cases of squamous cell carcinoma， 23 cases of adenocarcinoma and 10 cases of small cell lung cancer were selected as experimental group. 10 cases of benign lung lesions were used as control group. The expression of RKIP was detected by immunohistochemistry and observed in different types of lung cancer. Differences and relationships with clinical staging. Results  Compared with the control group， the expression level of RKIP in the experimental group decreased，the difference was statistically significant （P<0.05）. The lowest expression of RKIP in the experimental group was small cell carcinoma， followed by squamous cell carcinoma and re-adenocarcinoma. Further studies on adenocarcinoma found that RKIP was lower in stage III and IV than stage I and stage II. Compared with stage I， RKIP was slightly decreased in stage II， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. Compared with stage III， RKIP expression was slightly decreased in stage IV， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. The expression trend of phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2） was opposite to that of RKIP， and the expression was significantly increased in stages III and IV compared with stage I and II. Correlation analysis showed that RKIP was negatively correlated with p-ERK1/2 expression （r=-0.893， P<0.05）. Conclusion  The loss of RKIP expression may promote the phosphorylation of ERK1/2， which promotes the occurrence and development of lung cancer. Therefore， the detection of RKIP expression may have important clinical value in the diagnosis of lung cancer and staged prognosis.

Key words：RKIP;ERK1/2;Lung cancer;Adenocarcinoma;Cancer staging

肺癌（lung cancer）为世界范围内各类肿瘤死亡率之首，全球每年大约有160万例新增肺癌患者及140万例肺癌死亡患者，而且大部分发生在发展中国家[1]，已经成为我国高发病率及高死亡率的恶性肿瘤之一，严重影响我国人民的健康，给社会、经济和家庭带来了沉重的负担[1]。肺癌分为非小细胞肺癌及小细胞肺癌，约80%的患者是非小细胞肺癌，且50%～70%的患者诊断时已经是晚期。因此，肺癌的早期诊断、临床分期的早期评估在诊断和治疗过程中尤为重要。Raf激酶抑制蛋白（RKIP）是一种小分子保守蛋白，能够抑制Raf/有丝分裂原激活蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，抑制Raf和MEK结合，从而抑制Raf介导的MEK磷酸化，对ERK信号通路起到负调控的作用[2]。RKIP在人体组织中广泛表达，既往研究发现，RKIP可能对癌细胞的转移起抑制作用。本研究探讨了在不同类型肺癌组织中RKIP及ERK1/2磷酸化的表达变化，以及这种变化与临床分期的关系，以期能够为肺癌的发生发展以及对未来肺癌的治疗奠定一定的理论基础。

1资料和方法

1.1一般资料  本研究所用标本均来自2017年1月～2019年8月安徽医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科（干部，西一，西二病区）住院患者，均为初次诊断，未接受治疗，标本为气管镜下活检，或CT引导下肺穿取肺癌组织。研究对象根据病例诊断分为对照组和实验组。对照组为良性病变10例;实验组即肺癌组总计54例，包括鳞癌21例、腺癌23例及小细胞肺癌10例，所有病例均由病理学确诊。

1.2方法  免疫组化的方法检测RKIP和p-ERK1/2的表达：5 μm石蜡组织切片二甲苯脱蜡2次，每次10 min;梯度乙醇水化，具体如下：100%乙醇2次，每次5 min;90%乙醇2次，每次5 min;80%乙醇2次，每次5 min;70%乙醇水化2次，每次5 min。PBS浸泡2次，每次5 min;蒸馏水浸泡2次，每次5 min;0.3%H2O2去离子水孵育10～30 min，灭活内源性过氧化物酶活性;蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）浸泡，微波750 w抗原修复2次，每次5 min，自然冷却。血清封闭，室温30 min;加入一抗孵育，4℃过夜，复温2 h。PBS冲洗5次，每次3 min;加辣根过氧化物酶标记标记的二抗孵育，室温1 h。PBS冲洗5次，每次3 min;氧化二氨基联苯胺显色5～10 min;自来水充分冲洗;10%苏木精复染    2 min，盐酸酒精分化;自来水冲洗10～15 min;梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封片。抗体及相关试剂为即用型，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3结果判断  肺癌患者临床特征按照年龄、性别、肿块大小、淋巴结转移和分期进行分析整理;低表达和高表达的定义如下：染色强度（阴性：0，弱：1，中等：2，强：3）乘以阳性肿瘤细胞百分比（<5%：0，6%～25%：1，26%～50%：2，50%～75%：3，>75%：4）。评分值<3被认为是低表达，4～12被认为是高表达。即免疫组化染色表达评分值=染色深度（阴性：0，弱：1，中等：2，强：3）×阳性肿瘤细胞的百分比×100%。

1.4统计学处理  采用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，多组之间比较采用ANOVA检验，组间比较采用t检验。计数资料使用[n（%）]表示，采用？字2检验。RKIP与p-ERK1/2相关性采用Pearson相關性分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1肺癌患者临床特征与RKIP的表达  纳入分析的肺癌患者临床特征包括年龄（≥60岁、<60岁），性别（男、女），肿块大小（≤3 cm、>3 cm），淋巴结转移（有、无），分期（Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期）。结果显示，RKIP的表达高低，不受年龄、性别影响（P<0.05）;肿块大小对RKIP的影响大于年龄和性别，肿块越大，RKIP的表达值越低，但差异无统计学意义（P>0.05）。淋巴结转移对RKIP的表达有影响，淋巴结有转移时RKIP的表达低于淋巴结无转移时，差异有统计学意义（P<0.05）。肺癌的分期对RKIP的表达有影响，RKIP的表达在Ⅰ～Ⅱ期高于Ⅲ～Ⅳ期，差异有统计学意义（P<0.05），即RKIP的表达在Ⅲ～Ⅳ期，有淋巴结转移时显著降低，见表1。

2.2 RKIP在不同类型肺癌中的表达变化  实验组RKIP表达较对照组低，其中RKIP在小细胞癌基本无表达，因此，直方图未显示RKIP在小细胞癌中的表达。RKIP的表达在腺癌，鳞癌呈下降趋势，但鳞癌与腺癌RKIP表达比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

2.3 RKIP在肺腺癌不同分期中的表达变化  从Ⅰ～Ⅳ期RKIP的表达逐渐减低，但RKIP在Ⅰ期和Ⅱ期中的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;在Ⅲ期和Ⅳ期中的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;与Ⅰ和Ⅱ期比较，RKIP在Ⅲ期和Ⅳ期中表达降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.4磷酸化ERK在肺腺癌不同分期中的表达变化  从Ⅰ～Ⅳ期，p-ERK1/2的表达逐渐升高，但p-ERK在Ⅰ期和Ⅱ期中的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;在Ⅲ和Ⅳ中的表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;与Ⅰ和Ⅱ期比较，RKIP在Ⅲ期和Ⅳ期中表达升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。

2.5肺腺癌中RKIP和p-ERK1/2表达的相关性分析  Pearson相关性分析结果进一步显示在肺腺癌中RKIP与p-ERK1/2的表达呈负相关（r=-0.893，P<0.05），即RKIP表达值越大，p-ERK1/2表达值越小，RKIP表达值约小，p-ERK1/2表达值越大，见图4。

3讨论

肺癌已经成为世界最常见的恶性肿瘤之一，是导致我国恶性肿瘤死亡的重要疾病原因。肺癌包括非小细胞癌和小细胞癌;非小细胞型肺癌又包括鳞状细胞癌（鳞癌）、腺癌、大细胞癌。与小细胞癌相比，非小细胞癌扩散转移相对较晚。但多数肺癌患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。肺癌的预后极差，生存时间短，与肿瘤细胞侵袭性和长距离转移密切相关[3]。本研究中，与对照组中的强表达比较，肺癌组织中RKIP的表达均明显减低，而且在小细胞癌中最为显著。临床分期越晚，RKIP表达水平越低。70.00%的淋巴结转移患者的RKIP表达水平非常低，而41.18%的淋巴结转移阴性患者的RKIP表达水平非常低，表明肺癌的转移与RKIP表达水平呈负相关的关系。通过检测肺癌组织中的RKIP的表达水平可以预测肿瘤的转移和分期，表达越低，远处转移的可能性越大，分期越晚，预后可能也越差。

RKIP在肺癌中的具体发挥作用的机制目前尚不完全明确。Raf激酶能够激活ERK信号通路激活转录活性，从而促进细胞的增殖、分化和转移。RKIP是ras有丝分裂原激活蛋白激酶和ERK信号通路的负调节因子[4]。既往研究已经证实，RKIP表达水平在所有非癌性前列腺组织中均可检测到，但是在所有转移性前列腺癌中都明显降低或不可检测的水平[5]。本研究结果显示，p-ERK1/2与RKIP的表达完全相反，临床分期越晚，p-ERK1/2表达越高。而且进一步的相关性分析显示二者呈负相关，说明了在肺癌中，RKIP的表达降低，ERK信号通路的负调节降低，促进了ERK信号通路的激活，导致了肺癌细胞的增殖和转移，与Wang A等[5]研究结论一致。同样，在恶性黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、甲状腺癌和肝脏也有类似的结果。

综上所述，RKIP表达水平的缺失可能促进了肺癌的发生及发展，检测RKIP的表达水平可能对诊断肺癌及分期预后有重要的临床价值。未来需要对RKIP的作用机制进行深入的研究，期望能对肺癌的诊断和治疗奠定一定的理论基础。

参考文献：

[1]陆方晓，阮磊.肺癌的CT征象与表皮生长因子受体基因突变相关性的研究进展[J].实用医学影像杂志，2019，20（2）：167-170.

[2]Roberts PJ，Der CJ.Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer[J].Oncogene，2007，26（22）：3291-3310.

[3]支修益，石远凯，于金明.中国原发性肺癌诊疗规范（2015年版）[J].中华肿瘤杂志，2015，37（1）：67-78.

[4]周凯，张颖异，岑瑛，等.Raf激酶抑制蛋白对恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移的影响及其机制[J].中华医学杂志，2019，99（8）：616-620.

[5]Wang A，Duan G，Zhao C，et al.Reduced RKIP expression levels are associated with frequent non-small cell lung cancer metastasis andSTAT3 phosphorylation and activation[J].Oncology letters，2017，13（5）：3039-3045.

收稿日期：2019-9-3;修回日期：2019-9-15

編辑/肖婷婷