大鼠骨骼肌浸渍液电导率及其化学物质含量与死亡时间的关系

郑哲，翟仙敦，夏志远，李永林，赵琳琳，刘慧丽，莫耀南

（1.河南科技大学法医学院，河南 洛阳 471003；2.中国政法大学证据科学研究院，北京 100088；3.河南科技大学医院，河南 洛阳 471003）

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断一直是法医病理学研究的热点与难点问题。根据尸体温度下降的规律推断PMI是法医工作中最常用的方法，该方法在死后12h以内效果最佳，24h以后意义较小[1]。而根据晚期尸体现象的变化推断PMI所得结果误差较大。近年来，法医学者对PMI推断的研究方法也越来越多[2-3]。由于尸体腐败极其复杂，且研究条件具有局限性，寻找准确、快速、实用的PMI推断方法，始终是这一研究领域的重要任务。

前期研究结果[4]发现，大鼠死后骨骼肌电导率（electrical conductivity，EC）与晚期PMI显著相关，提示EC用于推断PMI方面的良好前景。从EC形成机制的角度来说，是由溶液中多种带电离子的导电作用综合而成[5-6]。因此，本研究将测定骨骼肌组织中常见的水溶性化学物质的含量，探究骨骼肌浸渍液的EC及其生化指标的变化规律。

1 材料与方法

1.1 实验动物的分组、处理及保存

健康SD大鼠40只（由河南科技大学动物实验中心提供并通过动物伦理委员会批准），雄性，体质量（300±20）g，采用颈椎脱位的方法将其全部处死后随机分成8组［死后即刻（0d）、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d］，每组5只，保存于25℃左右的密闭环境中。

1.2 主要实验仪器

基础型台式电导率仪（FE30K，上海上天精密仪器有限公司），ZY-1280全自动生化分析仪（上海科华生物工程股份有限公司），Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司），Discovery电子天平（美国OHAUS公司），KFR-26GW变频空调（珠海格力有限公司），RC-5 24小时动态温度监测仪（浙江易控电子科技有限公司）。

1.3 骨骼肌EC及化学成分的测定

分别于死后即刻（0d）、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d，每只大鼠提取5g双下肢骨骼肌，置于研钵中并用剪刀剪碎、研磨，将骨骼肌组织与超纯水按照一定的比例混匀制成质量浓度为0.1 g/mL的匀浆浸渍液[7]。在研磨过程中，不间断地测定EC值，直到EC值达到最大不再增长时，即为本次研磨的终点。随后将浸渍液进行过滤，用基础型台式电导率仪测量滤液EC值并记录（电导率仪温度补偿系数设定为α=2%/℃）。所有上述滤液样本均使用ZY-1280全自动生化分析仪测定其钾离子、钠离子、氯离子、钙离子、镁离子、无机磷、尿酸、尿素氮、肌酐9种化学物质含量。

1.4 数据统计与分析

使用SPSS 13.0软件（美国IBM公司）进行统计分析，每组实验数据以表示，对各个化学指标不同时间点的原始数据作重复测量方差分析。以大鼠骨骼肌浸渍液EC及各生化指标数值为自变量（x），PMI为因变量（y），分别建立PMI随各指标变化的一次、二次、三次回归方程，以校准R2值最高者为最佳拟合方程。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 骨骼肌浸渍液EC与PMI的关系

表1显示：大鼠死后7d内，其骨骼肌EC值随PMI的延长而逐渐增大，其中0～1d，EC增长不明显，处于平台期；2～7 d，其EC值迅速增大，处于快速增长期。对不同时间点的EC值作重复测量方差分析并建立EC（x1）与PMI（y）的二次回归方程：

表1 各组骨骼肌电导率（n=5，±s，μS/cm）

表1 各组骨骼肌电导率（n=5，±s，μS/cm）

注：1）与相邻上组相比，P＜0.05。

死亡时间/d 电导率0 1 2 3 4 5 6 7 1397.63±18.45 1431.02±45.54 1718.08±232.871）2115.44±232.171）2748.67±543.921）3088.00±593.101）3504.09±661.231）4308.07±669.721）

2.2 骨骼肌浸渍液化学成分含量与PMI的关系

2.2.1 尿酸、尿素氮

表2显示：大鼠死后7d内，其骨骼肌浸渍液中尿酸、尿素氮的含量随PMI的延长而逐渐增多，两种化学物质的含量在1d内均无明显增长，而在2～7d内开始快速上升，其整体变化规律均与EC大致相同，对不同时间点的尿酸、尿素氮的测定值作重复测量方差分析并建立尿酸（x2）及尿素氮（x3）与PMI（y）的二次回归方程：

2.2.2 无机磷、镁离子

无机磷的含量随PMI的增加而逐渐增多，镁离子的含量则逐渐下降，但两种化学物质在0～7d内的整体变化幅度均较小。对不同时间点的无机磷、镁离子的测定值作重复测量方差分析并建立无机磷（x4）及镁离子（x5）与PMI（y）的回归方程：

表2 各组骨骼肌浸渍液生化指标 （n=5，±s）

表2 各组骨骼肌浸渍液生化指标 （n=5，±s）

注：1）与相邻上组相比，P＜0.05。

尿素氮/（mmol·L-1）0.68±0.14 0.69±0.08 2.22±1.341）2.82±1.361）4.16±3.221）6.55±2.231）8.12±2.661）12.19±3.641）0 1 2 3 4 5 6 7 15.60±6.43 17.20±3.03 27.00±8.631）46.40±31.901）75.00±56.001）128.60±43.501）138.21±43.031）235.62±35.731）4.26±0.25 4.27±0.281）4.40±0.141）4.50±0.181）4.64±0.181）4.73±0.141）5.01±0.261）5.45±0.351）1.82±0.04 1.83±0.061）1.70±0.141）1.63±0.151）1.67±0.131）1.48±0.121）1.23±0.321）1.19±0.191）9.62±0.45 8.78±0.70 8.60±0.40 8.24±0.50 8.22±0.42 8.15±0.42 8.66±0.39 8.45±0.35 0.17±0.02 0.22±0.02 0.26±0.03 0.23±0.05 0.25±0.04 0.19±0.08 0.17±0.12 0.11±0.10 9.20±5.63 37.80±4.38 42.40±22.48 80.40±56.88 58.00±47.11 34.20±47.25 68.60±82.81 16.20±18.14死亡时间/d 尿酸/（μmol·L-1）无机磷/（mmol·L-1）镁离子/（mmol·L-1）钾离子/（mmol·L-1）钙离子/（mmol·L-1）肌酐/（μmol·L-1）

2.2.3 钾离子、钠离子、氯离子、钙离子、肌酐

对不同时间点各组的钾离子、钙离子及肌酐的测定值作重复测量方差分析，结果显示，钾离子（P=0.922）、钙离子（P=0.086）和肌酐（P=0.152）3种生化指标随PMI的变化差异无统计学意义。钾离子在测定区间0～7 d内其含量始终在一定的区间范围内波动，基本保持稳定；钠离子、氯离子在0～7d内均检测不到其浓度值；钙离子、肌酐虽然在0～7d内均能检测到，但在此测定区间内两种物质的变化差异无统计学意义，与PMI的相关性不佳。

3 讨 论

食品科学在评价肉类新鲜程度及货架期方面有较为成熟的指标，如EC、挥发性盐基氮、菌落总数、丙二醛的含量等[8-9]。在这些指标中，EC的检测具有快速、简便、经济等特点，目前已广泛用于食品卫生等领域。其基本原理为：随着肉制品的腐败变质，其组织内大分子如核酸、蛋白质、脂肪、糖类等在酶和微生物的作用下逐渐降解为低分子导电性物质，因此，其导电小分子越多，EC值越大，肉制品的腐败变质程度越高[10-11]。法医学中死后尸体的变化规律与肉类的腐败变质类似，在腐败菌群及腐败微生物的作用下，尸体组织发生类似降解，随着腐败的进行，导电小分子物质不断积累，其EC值亦会逐步增加。

夏志远等[4]的研究结果发现，EC值与晚期PMI显著相关。在此研究成果的基础上，本研究进一步对部分EC相关性的化学成分进行研究，测定了大鼠骨骼肌中钾离子、钠离子、氯离子等9种常见的化学物质的含量，分析单个具体的生化指标随PMI的变化规律，探究EC变化机制的同时通过对多指标的分析提高PMI推断的准确性。本研究选取骨骼肌为研究对象，因其血供较少，且由皮肤包绕，在死后受外界因素影响较小，整体来说较为稳定，是用来研究PMI的最佳选择[12]。选用去离子水与骨骼肌样本混匀可以避免外界离子对EC形成的干扰，达到对EC研究的最佳效果。前期实验结果[4]表明，组织浸渍液温度每增加1℃，其实际测定的EC值增加约2%。因此，我们将电导率仪的温度补偿系数设定为2%，不同温度下所测定的溶液EC值按照2%的补偿系数自动补偿至25℃下的标准值。

本研究测定并研究了包括骨骼肌浸渍液中EC及9种常见的化学成分，实验结果显示：大鼠骨骼肌EC值随PMI的增加而逐渐增高，与PMI的相关性较好，死后1d内EC增长不明显，处于平台期，骨骼肌腐败不明显；1d后随着腐败的发展，EC值开始逐渐增大，进入快速增长期。这与前期实验结果[4]相符合，同时也证明了EC在用于PMI推断方面的稳定性。

随着尸体腐败的进行，蛋白质、核酸等逐渐降解，产生的碱性含氮类物质逐渐增多[13]，尿酸与尿素氮为腐败的主要产物之一。本研究结果显示，0～7 d内大鼠骨骼肌浸渍液中尿酸、尿素氮的含量随PMI的延长而逐渐增多，两种物质的变化规律类似且与PMI的相关性均较好。其中0～1d，两者的含量均无明显上升，处于平台期，说明在1d内大鼠骨骼肌腐败不明显；而1～7d，随着腐败的充分发展，两者的含量随PMI的延长而快速增加，其整体变化趋势与EC保持一致。尿酸及尿素氮的含量变化某种程度上代表蛋白质、核酸等的降解程度，其变化规律不仅可以印证EC的变化机理，同时也可以辅助EC对于PMI的推断。

大鼠死后0～7d内无机磷的含量随PMI的延长而逐渐增多，其原因可能为死后细胞逐步发生降解，细胞基本结构被破坏，其生物膜中的磷被释放出来而导致磷的含量逐渐增多[14]；而镁离子的含量则逐渐降低，其原因可能为死后镁离子与某种化学物质结合成络合物难以分离，因而其含量逐渐降低。无机磷与镁离子两种生化指标与PMI的相关性均较好，但两者的整体变化幅度均较小。在死后的特定时间段内，两者的变化规律仍可以辅助推断EC的变化趋势。

大鼠死后0～7 d，骨骼肌浸渍液中钾离子、钙离子、肌酐的含量均在一定范围内波动，但三种化学物质的整体变化差异无统计学意义，在晚期PMI推断方面意义较小；而钠离子、氯离子两种物质均在仪器最低检测限之下，其原因可能为两者均存在于细胞间质，本研究虽对组织细胞进行破坏，但其胞内钠离子、氯离子的含量较低，导致其离子的总含量仍较低，检测含量仍在标准曲线最低检测限之下，亦不会随PMI的增大浓度逐渐增大，因此，此两者同样不适合用于晚期PMI的推断。虽然钾离子、钠离子、氯离子、钙离子和肌酐5种生化指标与PMI相关性不佳，但其测定结果为后续研究提供了基础数据。

综上所述，本研究通过对大鼠死后不同间隔时间骨骼肌浸渍液中EC及钾离子、钠离子、氯离子等9种化学物质含量的测定，在分子变化的基础上探究了EC随PMI的变化机制，其中尿素氮、尿酸等与PMI的相关性极好，在联合EC推断PMI方面展现出良好的研究价值，为多指标联用推断PMI提供了一定的研究基础。但死后腐败变化极其复杂，多种影响因素（温度、湿度、氧分压等）综合作用下EC的变化规律将是未来的研究方向。