注射用头孢美唑钠高分子杂质鉴定方法研究

2019-12-27庞文哲高燕霞

中国药业 2019年24期

韩彬，庞文哲，高燕霞

（河北省药品检验研究院，河北石家庄 050011）

头孢美唑钠是第2代头孢菌素类半合成抗菌药物［1］，对革兰阳性菌和革兰阴性菌的抗菌效能均良好，广泛应用于临床［2-5］，对多种 β-内酰胺酶稳定，体内分布好、不良反应少［6］。研究表明，β-内酰胺类抗菌药物引发的速发型过敏反应与药物中存在的高分子聚合物杂质有关［7-8］。头孢美唑钠聚合物测定方法收载于2015年版《中国药典（二部）》［9］，采用分子排阻色谱法（Cef-SEC）对其高分子聚合物进行测定，但实际试验结果表明，葡聚糖凝胶G-10色谱柱的柱效较低，分离效果较差，峰形拖尾较严重，且测定分析时间较长。本研究中建立了以WT-Cef-SEC为色谱柱的高效分子排阻色谱法测定头孢美唑钠中的聚合物，该法分离效能高、分析时间短、专属性强、灵敏度高，并通过在线脱盐质谱联用法证明了其结果准确可靠。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效分子排阻色谱（2D LC/LCMS-IT-TOF）系统，包括LC-20AD型输液泵（4个），SIL-20AC型自动进样器，CTO-20AC型柱温箱，CBM-20A型系统控制器，DGU-20A5型在线脱气机，SPD-M20A型二极管阵列检测器（DAD），SPD-20A型紫外检测器，FCV-12AH型流路选择阀（3个），FCV-14AH型色谱柱切换阀（2个），离子阱-飞行时间质谱（LCMS-IT-TOF）仪和LC MS solution Ver.3.80色谱工作站（日本岛津公司）。

1.2 试药

注射用头孢美唑钠（河北某药厂，批号分别为18101701，18101702，18101703，规格为按 GsH17N7O5S3计每次0.5 g）；头孢美唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号为130580-201301，含量为86.9%）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 检测条件

二维液相系统色谱条件：通路1，色谱柱为WT-Cef-SEC 柱（300 mm ×7.8 mm，5 μm），流动相为5 mmol/L乙酸铵溶液 -乙腈（95 ∶5，V/V），流速为 0.6 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30℃，进样量为20 μL。通路2，色谱柱为InertSustainTMC18柱（50 mm×2.1 mm，2 μm），流动相为水 -乙腈（70 ∶30，V/V），检测波长为254 nm，柱温为 30℃，流速为0.3 mL/min，进样量为 20 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），接口电压4.5 kV，扫描范围一级质谱为m/z200～1500；自动多级质谱为m/z100～1 000；雾化气为氮气（流速为 1.5 L/min），干燥气为氮气（流速为10 L/min），碰撞气为氩气，脱溶剂管及加热模块温度均为200℃，检测器电压1.65 kV，校准方法为自动调谐优化电压，外标法校准质量数。

2.2 溶液配制

称取样品50 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，作为供试品溶液（临用新制）；另取头孢美唑对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL中约含5 μg的对照品溶液。

2.3 系统适用性试验

取供试品溶液适量，按2.1项下通路1液相色谱条件进样分析，色谱图见图1。高效分子排阻色谱法检测时，大分子量的化合物先出峰，因此，主峰前的峰为聚合物峰。其中聚合物1含量低于0.05%，聚合物2和聚合物3为头孢美唑钠主要高分子杂质。

图1 头孢美唑钠高效液相色谱图

2.4 聚合物结构鉴定

在2D-LC-IT-TOF/MS系统中，将头孢美唑钠主峰切换到LOOP环1中，经通路2液相色谱条件进样分析，得MS色谱图和多级质谱图，详见图2和图3。头孢美唑钠相对分子质量493.027 3，一级质谱图中［M+H］+为m/z494.032 9，与软件计算理论值m/z494.034 6一致。

将聚合物3切换到LOOP环2中，经通路2液相色谱条件进样分析，得MS色谱图和多级质谱图，详见图4和图 5。一级质谱图中［M+H］+为m/z987.705 2，是头孢美唑钠相对分子质量的2倍，二级质谱图中m/z495.825 6碎片为聚合位点的酰胺键断裂形成的头孢美唑钠单体碎片。

将聚合物2切换到LOOP环3中，经通路2液相色谱条件进样分析，得MS色谱图和多级质谱图如图6和图 7。一级质谱图中［M+H］+为m/z1 480.138 7，是头孢美唑钠相对分子质量的3倍。在二级质谱图中m/z986.686 5碎片为聚合位点的酰胺键断裂形成的头孢美唑钠二聚体碎片。

图2 头孢美唑钠离子流图

图5 聚合物3多级质谱图

2.5方法学考察

专属性试验：称取注射用头孢美唑样品50 mg，置10 mL容量瓶中，平行5份，分别进行高温（60℃下放置10 min）、酸破坏（0.1 mol/L HCl 1 mL，放置 1 min，取0.1 mol/L NaOH溶液1 mL中和）、碱破坏（0.1 mol/L NaOH 溶液 1 mL，放置 1 min，取 0.1 mol/L HCl溶液1 mL中和）、强光（3 500 lx强光照射 12 h）、氧化破坏（30%H2O21 mL，放置 1 min）加速破坏操作，按 2.1项下通路1液相色谱条件进样分析，记录色谱图。主峰与以上破坏产生的降解物峰均能获得良好分离，不干扰聚合物的测定。

图7 聚合物2二级质谱图

线性关系考察：取头孢美唑对照品适量，精密称定，用水溶解并制成质量浓度分别为0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 的系列溶液，取 20 μL，按 2.1 项下检测条件进样测定。以峰面积（A）为纵坐标、质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，得回归方程A=185.55C-13.213，r=0.999 9（n=5）。结果表明，头孢美唑质量浓度在0.5～20.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限和检测限检测：取对照品溶液，加水倍比稀释，按2.1项下检测条件进样测定。以信噪比（S/N）为10计，头孢美唑的定量限为3 ng，以S/N为3计，头孢美唑的检测限为1 ng。

精密度试验：取对照品溶液，按2.1项下检测条件进样测定，重复进样5次。结果的RSD为0.16%（n=5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为18101701）50 mg，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，平行操作6份，按2.1项下检测条件进样测定。结果聚合物2和聚合物3平均含量分别为0.2%和0.1%，RSD分别为0.1%和0.3%（n=6），表明方法重复性良好。

2.6 测定方法

因头孢类聚合物对照品不稳定较难获得［10-11］，但其聚合物为自身聚合而成，紫外吸收官能团一致，在各种浓度下，聚合物峰与主峰的紫外吸收一致，故聚合物含量的测定均按不加校正因子的主成分自身对照法计算。取3批样品，分别按2.1项下通路1液相色谱条件及2015年版《中国药典（二部）》收载的聚合物检测方法测定。结果见表2。按外标法以峰面积计算，含头孢美唑钠聚合物以头孢美唑计，规定限度为多聚物不得超过0.3%，二聚物不得超过0.5%。

表2 样品含量测定结果（%，n=3）

3 讨论

3.1 在线脱盐液质联用技术

本试验中采用2D-LC-IT-TOF/MS法对注射用头孢美唑钠聚合物进行鉴定［12］。该方法基于一组共用的馏分收集环的二维液相质谱联用系统建立，对目标峰快速分析的同时可完成流动相转换即脱盐过程，在不改变原流动相条件的基础上，实现了液质联用分析目标杂质，其中通路1液相色谱条件通过时间程序控制自动对分离过程中的目标杂质进行捕集；通路1液相色谱条件分析结束后，批处理自动执行通路2液相色谱条件分析，此时捕集在1个或多个馏分收集环中的杂质组分分批依次通过适合质谱分析的流动相注入通路2液相色谱柱中，可在准确推定检出杂质结构的同时，又能实现对一维液相色谱条件下色谱图中各杂质的准确定位。

3.2 色谱柱选择

文献资料键合球状蛋白色谱用亲水硅胶柱，聚合物峰与主峰之间的分离度有很大改善，但聚合物峰检出数量少［13-14］。本研究中选择的 WT-Cef-SEC色谱柱（Sepax公司）采用专利的表面修饰技术，独有的化学修饰技术可精确控制亲水涂层的厚度，聚合物峰与主峰之间的分离度有很大改善，同时具有更宽的耐用性和更强的分离效果，可更好地控制产品质量，为企业改善生产工艺提供了技术支持。