何首乌组培快繁技术研究

倪荣兴 陈晓欣 郭梓杰

摘要    为建立道地种源德庆何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）组培快速繁殖体系，为生产提供优质种苗，本文以何首乌的带腋芽茎段为外植体，通过单因素变量法探究何首乌丛生芽、生根和炼苗的适宜条件。结果表明，诱导何首乌外植体丛生芽的适宜配方为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;诱导何首乌生根的适宜配方为1/2 MS+0.1 mg/L NAA，生根率达100%;建立了道地种源德庆何首乌组培快速繁殖体系。

关键词    何首乌;快速繁殖;组织培养

中图分类号    S567.23+9        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）21-0075-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    In order to establish a rapid propagation system of Polygonum multiflorum Thunb.，provide the high-quality seedlings for production，the stems of the roots of Polygonum multiflorum Thunb. were used as explants，and the single-factor variable method was used to explore the growth of suitable conditions for buds，rooting and seedling adaptation. The results showed that the suitable formula for inducing shoots of Polygonum multiflorum Thunb. explants was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，the suitable formula for inducing rooting of Polygonum multiflorum Thunb. was 1/2 MS+0.1 mg/L NAA，the rooting rate was 100%.

Key words    Polygonum multiflorum Thunb.;rapid propagation;tissue culture

中药何首乌来源于蓼科植物何首乌（Polygonum multifl-orum Thunb.）的干燥块根，主要成分有二苯乙烯苷、蒽醌类等[1]。

有研究表明，何首乌具有抗衰老[2]、抗抑郁[3]、抗癌[4]等作用。随着现代工业的发展，何首乌的用途由传统医药行业拓展到保健、化工等行业，具有广阔的开发利用前景[5]。为应对何首乌资源日益减少的现状，亟需进行何首乌人工繁殖[6]。本文以何首乌道地产区德庆种源何首乌为研究对象，建立何首乌快速繁殖体系。现将试验结果总结如下。

1    材料与方法

1.1    試验材料

本试验材料采自广东省德庆县，经广东药科大学中药学院严寒静教授鉴定为德庆种源何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）。

1.2    试验方法

1.2.1    外植体消毒灭菌。采集何首乌的带腋芽茎段作为外植体，用自来水冲洗20 min后，用75%乙醇浸泡30 s，再用无菌水冲洗3次，然后用0.1%氯化汞溶液分别浸泡9、10、11、12 min（分别记为处理A1、A2、A3、A4），再用无菌水冲洗5次，把接触消毒液两端的损伤组织剪去，剪成长大约1.5 cm小段，每个小段带1个腋芽。把消毒后的外植体接种于MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基。根据0.1%氯化汞溶液处理时间不同，每组接种30瓶，每瓶接种3个外植体。在光照12 h/d、温度（25±2）℃的环境下培养10 d。之后，统计外植体的染菌率和存活率，筛选出外植体消毒的适宜时间。计算公式如下：

染菌率（%）=（染菌株数/接种总株数）×100;

存活率（%）=（丛生芽成活株数/接种总株数）×100。

1.2.2    茎尖丛生芽诱导。一是不同浓度6-BA对诱导丛生芽的影响。以MS培养基为基本培养基，设定NAA浓度为0.1 mg/L，设定6-BA浓度分别为1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L（分别记为处理B1、B2、B3、B4）。每组接种30瓶，每瓶接种3个外植体，在光照12 h/d、温度（25±2）℃的环境下培养30 d。二是不同浓度NAA对诱导丛生芽的影响。以MS培养基为基本培养基，设定6-BA浓度为筛选出的适宜浓度，设定NAA浓度分别为0.10、0.20、0.30 mg/L（分别记为处理B5、B6、B7），每组接种30瓶，每瓶接种3个外植体，在光照12 h/d、温度（25±2）℃的环境下培养30 d。

1.2.3    不同6-BA和NAA组合对芽增殖的影响。采用单因素变量法，以MS培养基为基本培养基，设定NAA浓度为0.1 mg/L，设定6-BA浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L（分别记为处理C1、C2、C3、C4）。每组接种30瓶，每瓶接种3个带1片叶子的丛生芽茎段，在光照12 h/d、温度（25±2）℃的环境下培养30 d。30 d后，统计外植体的增殖系数，筛选出诱导外植体丛生芽的最佳6-BA浓度。计算公式如下：

增殖系数=芽增殖数/接种总芽数

1.2.4    生根培养。当何首乌丛生芽长到6 cm左右，转移至含有0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mg/L NAA（分别记为处理D1、D2、D3、D4、D5、D6）的1/2 MS固体培养基中，每组接种20瓶，每瓶接种3个外植体，在光照12 h/d、温度（25±2）℃的环境下培养15 d。计算公式如下：

生根率（%）=（生根株数/接种总株数）×100

1.2.5    炼苗移栽。当生根后的何首乌组培苗长到6 cm左右，打开瓶盖在荫棚中适应3 d、开盖2～3 d后，再水培5 d，然后移栽到不同培养基质中。移栽基质分为营养土、河沙以及营养土+河沙（1∶1）3个处理（分别记为处理E1、E2、E3），每组15株，培养20 d，比较成活率和生长情况。计算公式如下：

成活率（%）=（炼苗成活株数/炼苗总株数）×100

2    结果与分析

2.1    不同消毒灭菌时间对外植体染菌率的影响

为了降低染菌率，需要对何首乌外植体进行消毒。由表1可知，使用75%乙醇消毒30 s，再用0.1%氯化汞溶液处理11 min，可以使何首乌的染菌率降低，存活率相对较高，达到较理想的灭菌效果。

2.2    不同6-BA和NAA组合对诱导丛生芽的影响

将何首乌外植体接种在含不同浓度外源激素组合的培养基上培养25～30 d形成丛芽。由表2可知，当NAA浓度为0.1 mg/L时，诱导丛生芽最佳的6-BA浓度为2.0 mg/L。当6-BA为2.0 mg/L、NAA为0.2 mg/L时，何首乌的增殖系数最高，达到9.94。

2.3    不同6-BA和NAA组合对芽增殖的影响

把组培苗小段接种于培养基7 d左右，可以看到何首乌开始抽芽，并且底部切口处膨大长出愈伤组织，叶子变绿，茎段变得粗壮，大约40 d形成丛芽。由此可见，芽增殖过程具有壮苗作用。由表3可知，当NAA浓度为0.1 mg/L、6-BA浓度为1.0 mg/L时，何首乌的增殖系数最高，达到6.38，小于诱导丛生芽的增殖系数。

2.4    不同浓度NAA对何首乌组培生根的影响

把何首乌组培苗带1个侧芽的茎段接种于含不同浓度NAA的生根培养基上，观察并记录何首乌的生根状况，统计其生根率。由表4可知，含有NAA的培养基较不含NAA的培养基生根率高，可见NAA具有促进诱导生根的作用。低浓度的NAA对诱导何首乌生根作用较好。随着NAA浓度的增长，大部分生根率下降。当NAA的浓度为0.1 mg/L时，何首乌的生根率最高，达到76.67%。

2.5    不同培养基质对炼苗移栽的影响

把何首乌组培苗移栽到室外的过程中，环境的温度、适度、空气、光照强度等都发生了较大的变化。为了增加成活率，应该让何首乌有一个适应的过程。试验结果显示，在荫棚中适应3 d、开盖2～3 d后，水培5 d再移栽，可使何首乌的成活率达到100%。本试验没有具体探讨适应、开盖、水培时间对成活率的影响，主要探究了营养土、河沙以及营养土+河沙（按1∶1比例混合）3个处理组对何首乌移栽后生长状况的影响。

把何首乌组培苗移栽后，可以观察到有河沙培养的植株由于缺乏营养，叶子变黄、长势缓慢、平均增加叶片数少。而处理E1、E3的何首乌生长逐渐健壮，叶子逐渐长大、变硬，绿色渐深，根须增多并且变长。营养土富含营养物质，为何首乌生长提供了适合的营养，促进了生长。由表5可知，使用营养土培养何首乌时，平均增加叶数最多，为8.2片。

3    结论与讨论

试验结果表明，当6-BA浓度为2.0 mg/L、NAA浓度为0.2 mg/L时，诱导何首乌丛生芽最好，与陈  菊等[7]、姚  焱等[8]的结果有所差异。不同来源的何首乌材料，其组织培养结果有差异，可能与种源不同或个体差异有关。一般来说，何首乌组培苗的炼苗成活率为90%左右。本试验结果成活率较高的原因可能是与种源有关，也可能与组培技术有关。

试验结果显示，河沙的植株生长状况较差，这是由于何首乌在生长过程中需要吸收一定的营养物质等，而河沙缺乏植物生长所需的营养物质。虽然使用营养土的增殖系数较使用营养土+河沙（按1∶1比例混合）处理的平均增加叶片数多1.6片，但是它们的生长情况都较好。如果营养土与河沙混合的比例合适，不仅能使何首烏达到较好的生长状态，而且能够降低成本。

把何首乌带腋芽茎段作为外植体，最佳的消毒灭菌条件为75%乙醇消毒30 s后，再用0.1%氯化汞溶液浸泡11 min;诱导何首乌外植体丛生芽时，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基较好，接种30 d后芽的增殖系数可达9.94;诱导何首乌组培苗芽增殖时，以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基较好;诱导何首乌组培苗生根时，以1/2 MS+0.1 mg/L NAA培养基较好，接种15 d后何首乌组培苗的生根率可以达77.73%，约20 d可达100%;炼苗移栽时，在荫棚中适应3 d、开盖3 d后，水培5 d再移栽，可使何首乌组培苗成活率达到100%;移栽培育的最佳基质为营养土，植株生长情况更好。

4    参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：175-176.

[2] 宋士军，李芳芳，岳华，等.何首乌的抗衰老作用研究[J].河北医科大学学报，2003，24（2）：90-91.

[3] 畅洪昇，鲁艺，王伟明，等.何首乌的抗抑郁作用及其对海马5HT_（1A）受体表达和神经细胞发生的影响[J].北京中医药大学学报，2012，35 （12）：822-825.

[4] CHEN H S，LIU Y，LIN L Q，et al.Anti-proliferative effect of an extract of the root of Polygonum multiflorum Thunb. on MCF-7 human breast cancer cells and the possible mechanisms[J].Mol Med Report，2011，4（6）：1313-1319.

[5] 黄和平，王键，黄璐琦，等.何首乌资源现状及保护对策[J].海峡药学，2013，25（1）：40-42.

[6] 刘运华，王凌晖，曹福亮，等.何首乌丰产栽培技术研究进展[J].安徽农业科学，2007，35（18）：5486.

[7] 陈菊，陈国惠.6-BA与NAA浓度配比对何首乌不定芽增殖的影响[J].中国农学通报，2006，22（11）：173.

[8] 姚焱，汪珍春，王小兰，等.广东道地中药何首乌的组织培养[J].北方园艺，34（7）：175-177.