贵州油茶叶枯病病原鉴定研究

秦绍钊 刘文霞 李御企 王洪

摘要：本研究采用形态学鉴定及多基因分子鉴定的方法，对贵州省油茶叶枯病病原进行分离、纯化和鉴定。根据形态特征，结合ITS1-TUB2基因所构建的系统发育树综合鉴定，结果表明本研究分离致病菌为拟盘多毛孢属的小孢拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）。分离菌株KLXY-7-3与 Genbank 中同源性较高的菌株序列比对分析，分别与小孢拟盘多毛孢菌MF375901.1、MK409844.1菌株聚为一个独立的进化分支，且置信度为99%。本研究系统调查采集贵州油茶主要种植区的典型病样，可为该病原菌发生规律及防治时期的研究提供理论依据。

关键词：油茶叶枯病;小孢拟盘多毛孢菌;形态学;多基因鉴定

中图分类号：S794.4

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191215005

油茶（Camellia oleifera）既是中国特有的木本油料作物，也是具有绿化功能的常绿小乔木，对于贵州省生态环境、社会效益和经济效益都具有重大意义。近几年，随着贵州省油茶优良新品种的引进和推广，油茶叶枯病的发生面积也呈上升趋势。叶枯病每年6—9月份为高发期，大部分感病叶片干枯面积达整片叶1/2以上。国内报道的拟盘多毛属真菌侵染油茶的菌种主要茶拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis theae）能引起油茶叶枯病[1，2]，小孢拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）引起油茶叶枯病[3，4]，熊朝伟等人仅对玉屏地区的油茶叶枯病有所报道[5]，但尚未对贵州油茶主要产区的叶枯病进行全面性调查研究。

本研究基于贵州省主要栽培园区调查的基础上，采集与上述报道中描述病征一致的病样，采用形态特征和ITS1-TUB2多基因相结合的鉴定方法。病原菌研究结果表明，引起贵州油茶叶枯病病原为小孢拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora），旨在为全省油茶叶枯病的预防和病原鉴定提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

2015—2018 年采集油茶叶枯病叶片标本于凯里市、黎平县、锦屏县及黄平县;玉屏县、石阡县、思南县及松桃县，分别集中于6—7月，10—11月采集病样，分离病健交界组织，PDA 培养3～5d后，冰箱内4℃保存备用。

典型病斑呈不规则状，红褐色至灰褐色，病斑连片成大枯斑;病叶中病健交界处产生黑色颗粒（如图1）。

1.2方法

1.2.1病原菌的分离纯化

常规组织分离法。先用75%的酒精处理病健交界的组织，0.1%升汞溶液消毒，无菌水漂洗干净，PDA培养基纯化培养，置于4℃下保存备用。

1.2.2病原菌的形态鉴定

取5mm菌饼，在PDA平板26～28℃黑暗16h培养，2～5d 连续观察菌落的形态、颜色。取10μL 分生孢子悬浮液在光学显微镜下观察记录其大小及形态特征。

1.2.3分子鉴定与系统发育分析

取50 mg 菌丝经液氮研磨，样品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒，Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒SK8259。扩增引物如下：Bt2a5GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3，Bt2b5ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3; ITS15TCCGTA GGTGAACCTGCGG3，ITS45TCCTCCGCTTATTGATATGC3。

将测序rDNA-TS1和rDNA-TUB2序列与 GenBank 中相关序列分别用ClustalX1.83软件进行比对分析。选出与各分离菌株相似度较高的相应序列，采用 MEGA7.0.14 软件中的邻接法（NJ）做聚类分析，把所有的碱基状态处理为无序，并给以相同的权重。自举检验重复1000次以获得各分支的支持率，构建邻近法（NJ）系统发育树。

2结果与分析

2.1病原菌菌落与形态特征

菌落为雪白色，菌丝贴近培养基，菌丝浓密，表面覆盖着粉红色茸毛状，由中央向边缘逐渐加厚呈明显轮纹状（图2A）;培养5～7d 时菌落直径7.9～9.0cm，菌落背面可见菌落因分泌色素而呈橙黄色;22℃培养5d后，菌落里面和菌丝表面可见散布的黑色小点即分生孢子盘（图2B）。

分生孢子为梭形，由5个细胞组成，两端有附属丝，中间细胞颜色较深，一端为1根，另一端为2～3根（如图3）;分生孢子大小为 （17.9～21.9） μm×（6.0～7.2） μm，具顶端附属丝2～3根，多数3根为主，长14.0～16.8 μm;基部无色胞锥形，狭长，具中生式柄1根，长3.0～5.2 μm。

根据病原菌的菌落及分生孢子的特征，初步鉴定为拟盘多毛孢属小孢拟盘多毛孢菌

（Pestalotiopsis microspora （SPeg.） G. C.Zhao et Li.comb.nov）[6]。

2.2分子鉴定

本研究以3个分离菌DNA 为模板，对其核糖体转录间隔区（ITS）和微管蛋白（TUB2）基因进行扩增并测序。NCBIBlastn比对后确定3个菌株同属小孢拟盘多毛孢菌，与形态学鉴定的结果一致。代表菌株KLXY-7-3的TUB2和ITS基因序列与其它同属菌株序列经邻接法（NJ）共同构建的系统发育树中，KLXY-7-3菌分别与小孢拟盘多毛孢菌（MK409844.1，MF375901.1）以99%的支持率聚为一个独立的进化分支，并且其它真菌均以高支持率同类相聚。因此，根据分离所得鉴定结果将KLXY-7-3菌株鉴定为小孢拟盘多毛孢菌（P. microspora）。

3结论与讨论

本文通过扩增拟盘多毛孢菌的ITS-TUB2基因序列，将所得序列与 GenBank中已有序列做比对，聚类分析结果显示，拟盘多毛孢菌形成2个大的聚类群，同时该菌株形态特征与赵光材[6]等人描述的P.microspora基本一致。因此，从形态学和分子方面证明该病原菌是小孢拟盘多毛孢菌（P.microspora）。

参考文献

[1] 卢东升，黄新华，代兵.信阳市油茶病害及其病原鉴定[J].东北林业大学学报，2012，40（5）：83-85，111.

[2] 廖旺姣，邹东霞，吳耀军，等.广西油茶苗期叶枯病病原菌鉴定[J].西南农业学报，2015，28（6）：2537-2540.

[3] 李河，周国英.油茶叶枯病原的形态及ITS序列分析鉴定[J].福建林学院学报，2008，28（1）：88-91.

[4] 牛晓庆，陈良秋，付登强，等.油茶叶枯病菌的鉴定及生物学特性研究[J].热带作物学报，2013，34（2）：352-357.

[5] 熊朝伟，阮成江，吴波，等.玉屏油茶叶枯病病原菌分子鉴定及防治药剂筛选[J].分子植物育种，2019，17（6）：1944-1950.

[6] 赵光材，李楠.拟盘多毛孢属在云南的34个种[J].东北林业大学学报，1995，23（4）：21-26.

作者简介：

秦绍钊（1981-），男，博士，副教授。研究方向：植物病害病原鉴定及综合防控。