正交设计优选益气化瘀补肾汤提取工艺

李卫先，刘园园

(湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)

“益气化瘀补肾汤”来源于祖传验方，处方以中医药理论为指导，遵循中医辨证论治的原则上组方而成，以益气、活血化瘀、补肝肾的药物黄芪、当归、海马等为君药，佐以三七、杜仲、牛膝、生地、丹参、红花、续断、威灵仙、甘草等补肝肾、利水、行气活血止痛的药物，经多年临床使用取得了非常满意的疗效。益气化瘀补肾汤药味较多，有效成分种类繁多，目前国内对益气化瘀补肾汤提取工艺尚无研究，检测单个指标的含量难以反映整体提取效果，本文以干浸膏得率和黄芪甲苷含量为考察指标，以提取次数、加水量、提取时间为考察因素[1-4]，采用四因素三水平的正交设计优化益气化瘀补肾汤的提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 HPLC高效液相色谱仪；R-1001N旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；DHG-9140A恒温鼓风干燥箱(上海宏都电子科技有限公司)；KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)；S205DU电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HH-8数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；98-02-B磁力搅拌电热套(大连枫洲科技有限公司)。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110781-201717)，益气化瘀补肾汤组方药材均由湖南中医药高等专科学校附属一医院提供，经湖南中医药高等专科学校李飞艳副教授鉴定，本实验所用药材质量均符合《中国药典》(2015年版一部)项下相关规定，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，正丁醇(分析纯)，氨水(分析纯)，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 干浸膏的制备

按处方比例，准确称取黄芪、三七、当归、杜仲、牛膝、生地、丹参、海马、红花、续断、威灵仙、甘草等12味药材，打粉过二号筛，混合均匀，精密称定，按照正交设计表提取、过滤，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃鼓风干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量[5-6]，计算干浸膏得率，干浸膏得率=干浸膏质量/原药材质量x100%。

2.2 黄芪甲苷含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(32∶68)为流动相，蒸发光散射检测器检测。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

2.2.2 对照品溶液的配制[7]

参照《中国药典》2015版一部方法，取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备[7～9]

精密称取组方药材粉末，按照正交设计表进行提取，过滤，参照《中国药典》2015版一部方法，用正丁醇振摇萃取4次，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，弃去氨试液，正丁醇液减压蒸干，残渣加适量甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，定容，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 正交试验结果及方差分析

表1 正交设计试验法因素水平表

选用提取次数(A)、加水量(B)和提取时间(C)为考察因素，每个因素取3个水平，以干浸膏得率和黄芪甲苷含量作为考察指标，设计L9(34)正交试验。正交试验因素水平见表1，正交试验设计与结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交设计试验安排表及干浸膏得率

由表2、表3可知，因素B(加水量)和因素C(提取时间)影响比较显著，且因素B>因素C，因素A(提取次数)影响不显著；通过极差大小分析，可以得出结论，影响提取效果的顺序为因素B > 因素C > 因素A，即加水量 > 提取时间 > 提取次数，且B3>B2>B1,C3>C2>C1,A1>A3>A2，因此最佳的提取工艺参数为A1B3C3，即提取一次，加12倍量蒸馏水，提取60 min。

表3 正交设计试验结果因素间方差分析表

注：方差分析采用LSD法(即最小误差法)。

2.4 水提工艺的验证试验

按处方比例准确称取药材100 g，按照正交试验结果得出的最优提取方式，将A1B3C3重复进行3次验证试验，结果见表4，结果干浸膏得率平均值为24.5% (RSD = 1.49%，n= 3)，黄芪甲苷含量为0.0460%(RSD = 1.81%，n= 3)，表明该工艺条件稳定、可行。

表4 正交设计验证试验结果

3 小结

组方中大部分药材有效成分均为水溶性成分，本试验用蒸馏水为溶剂对益气化瘀补肾汤进行提取，以干浸膏得率为考察指标，该工艺及设备简单，经济可行，为益气化瘀补肾汤的进一步研究和制剂开发研究提供依据；组方中黄芪、当归、海马等为君药，后续的开发研究中，还应检测阿魏酸、绿原酸等多个有效成分的含量，以更好地控制制剂的药效。