LHX6基因抑制肺腺癌的转移机制

张明谦 邓虹 李艳 陆爽 王媛 罗文娟 刘兴园

昆明医科大学附属延安医院急诊医学科（昆明650051）

肺癌远处转移是造成肺癌患者预后不良的主要因素之一［1］，常发生于肺腺癌及小细胞肺癌［2］，一旦发生肿瘤转移将严重影响肺癌患者的临床预后及生存时间，遗憾的是对已发生肿瘤转移的患者目前的临床治疗手段均无法有效抑制和治疗［3］。究其原因是对肺癌远处转移的机制尚未阐明，因此，深入开展对肺癌远处转移的机制研究对于降低肺癌病死率，改善临床预后有重要意义。

人类LHX6（LIM homeobox domain 6）基因是编码LIM 同源域的一类转录因子。课题组前期研究发现LHX6 基因在肺癌中是一个受甲基化调控的基因，初步生物学功能研究发现该基因具有抑制肺癌细胞增殖和迁移的作用，是一个典型的抑癌基因［4］，进一步利用公共数据库分析发现该基因与肺腺癌转移关系密切。因此，深入研究该基因抑制肺癌细胞增殖和迁移的分子机制，对于阐明该基因的生物学功能，探索新的肺癌防治思路尤为重要。

本研究采用体外实验和体内实验相结合的方法，利用Western Bolt、Top/Fop、闪光实验及荧光素酶报告实验等方法对LHX6 基因抑制肺腺癌转移的具体分子机制进行解析，并利用公共数据库分析该基因表达水平可能的临床意义，为进一步深入开展研究LHX6 基因提供数据和资料。

1 材料与方法

1.1 肺癌细胞系、裸鼠及所需抗体实验所需人类肺癌细胞株SPC-A-1、LTEP-A-2 和正常支气管黏膜细胞HBE 细胞均购自中国科学院生命研究资源中心（上海）。所有的细胞都是在相应培养基中培养（条件10%胎牛血清，温度37 ℃5%CO2培养箱）。

实验所需BALB/C-裸鼠8 只（4 周龄，18～20 g购自中国第三军医大学动物实验中心）安置在无菌环境下自由进食。所有的动物护理和程序符合美国国立卫生研究院的指导方针，动物所开展实验符合动物伦理学规定。

实验主要抗体包括anti-LHX6（1：1 000，购自Santa CruzBiotechnology），anti-CTNNB1（1：700，购自Santa CruzBiotechnology），anti-MMP7（1：1 000，购自Abcam），anti-c-Myc（1：1 000，购自Santa Cruz Biotechnology），anti-CCND1（1：1 000，购自Santa Cruz Biotechnology），anti-GAPDH（1：2 000，购自碧云天生物技术）。

1.2 实验方法

1.2.1 公共数据库分析LHX6 基因与肺腺癌转移的相关性及可能的信号通路利用公共数据库的肺癌表达谱数据（http：//kmplot.com/analysis），系统分析LHX6 基因表达与患者预后之间的关系；利用（http：//www.cbioportal.org）公共数据库分析LHX6基因表达与肺癌转移的关系；利用公共数据库（https：//genomecancer.soe.ucsc.edu/）分 析LHX6 基因表达水平影响肿瘤转移的关键基因表达情况。

1.2.2 裸鼠皮下成瘤实验BALB/C-裸鼠8 只［4周龄，体质量（18±1.9）g，雌雄比例1∶1］无菌环境下自由进食饲养，随机分为2 组（n＝4）。2 组小鼠分别在皮下注射空载体LTEP-A-2 细胞（8×106）及LHX6 过表达LTEP-A-2-LHX6 细胞（8 × 106），每周测量一次肿瘤体积（V＝1/2×A×B2，A 为长轴，B 为短轴），28 d 处死实验小鼠，切除肿瘤并称重，解剖小鼠观察肿瘤转移部位，小鼠肝脏切片及H&E 染色评估解剖观察转移情况。

1.2.3 细胞迁移和侵袭实验（Transwell 实验）采用24 孔8.0 μm Transwell 培养板，暗室上井注入空载体LTEP-A-2 细胞及LHX6 过表达LTEP-A-2-LHX6 细胞以及空载体SPC-A-1 细胞及LHX6 过表达SPC-A-1-LHX6 细胞（细胞注入量5 × 104/孔）及无血清培养基200 μL，暗室下井加入10%FBS 培养12 h（无基质胶迁移实验）及24 h（含基质胶侵袭实验），棉签除膜后取出上井，甲醇固定后0.1%结晶紫染色，高倍镜下随机6 个视野细胞计数，观察细胞迁移及侵袭能力，实验重复3 次。

1.2.4 Top/Fop Flash 荧光素酶实验根据LHX6基因启动子序列设计引物后克隆该基因启动子全长，克隆入荧光素酶表达载体（pGL3-Basic vector），将LHX6 基因启动子荧光素酶载体、LHX6/Vector 和内对照PRL-TK 质粒共转染肺癌细胞SPC-A-1、LTEP-A-2。36 h 后收细胞后采用Promega 双荧光素酶报告试剂盒（Dual Luciferase Kit）检测荧光素酶活性的变化，确定LHX6 能够抑制Wnt/βcatenin 信号通路的转录活性。

1.2.5 Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表达水平将过表达和干扰LHX6 表达的细胞收集后，提取总RNA 和蛋白质，采用RT-qPCR 和Western blot 检测Cyclin D1、MMP7、c-Myc 表达水平变化，引物设计如下（表1）。

1.3 统计学方法本实验数据均采用SPSS 19.0统计软件处理。数据以均值±标准差表示，组间比较应用Student′st检验或Mann-WhitneyU检验，Kaplan-Meier 生存曲线分析及Coxregression 回归分析用于LHX6 基因表达与肺癌预后及转移关系分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LHX6 基因与肺腺癌转移的相关性及可能信号通路分析通过公共数据库（http：//kmplot.com/analysis）分析LHX6 基因表达与临床预后关系发现，肺腺癌中LHX6 表达与患者预后明显正相关（图1A，n＝720，P＝0.000 58）；而在肺鳞癌，LHX6表达与患者预后不相关（图1A，n＝524，P＝0.14），通过表达谱数据（http：//www.cbioportal.org）分析发现LHX6 表达与肺癌转移呈显著负相关（图1B，P＝0.015），通过影响肿瘤转移的关键基因表达情况分析发现（https：//genomecancer.soe.ucsc.edu/），LHX6 高表达与基因CD44 及基因MMP7 的低表达密切相关（图1C），进一步通过公共数据库（TCGA https：//cancergenome.nih.gov/abouttcga/overview） 分析发现肺腺癌中LHX6 高表达与β-catenin 低表达相关，而在肺鳞癌中LHX6 表达与β-catenin 表达无关（图1D）。

表1 实时定量基因扩增荧光检测系统（qPCR）引物设计Tab.1 Design of primers for Real-time Quantitative PCR

图1 LHX6 基因表达水平和不同类型肺癌患者预后、转移及转移关键基因表达水平相关性分析（公共数据库分析）Fig.1 Analysis of the correlation between the expression level of LHX6 gene and the clinical outcome，metastasis and transfer key gene expression levels of patients with different types of lung cancer from public databases

2.2 裸鼠皮下成瘤实验为确定LHX6 基因高表达后具有明显的抑制肿瘤转移的作用，本研究通过裸鼠皮下成瘤实验进行验证，结果表明LHX6 基因过表达后裸鼠肿瘤体积明显减小（表2、图2A），同时通过对裸鼠肝脏切片观察发现，LHX6 基因过表达后成瘤裸鼠肝脏转移明显减少（图2B）。实验数据表明LHX6 过表达后可以明显抑制肺腺癌转移发生。

2.3 细胞迁移和侵袭实验（Transwell 实验）进一步通过细胞迁移和侵袭实验（Transwell 实验）确定LHX6 基因过表达后可以明显抑制肺腺癌细胞迁移及侵袭能力，实验结果显示LHX6 基因过表达后肺腺癌细胞株SPC-A-1、LTEP-A-2 迁移及侵袭能力均明显得到抑制（图3）。

2.4 Top/Fop Flash 荧光素酶实验及Wnt/βcatenin 下游基因蛋白及mRNA 表达水平检测由于LHX6 基因是一转录因子，笔者推测其抑制肺腺癌转移可能是通过与β-catenin 直接结合来调节其转录而实现，为验证这个假设，本研究进行了荧光素酶报告实验，数据显示LHX6 基因过表达后显著减弱了β-catenin 蛋白活性（图4A），接下来对Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表达水平进行了检测，结果发现其下游基因Cyclin D1、MMP7、c-Myc 均出现了表达下降情况（图4B 及图4C），进一步为了验证过表达LHX6 可以抑制Wnt/β-catenin信号通路，本研究对β-catenin 蛋白及mRNA 水平进行了检测，结果发现过表达LHX6 后β-catenin 蛋白及mRNA 水平均显著下调（图5A 及图5B）。实验数据表明LHX6 基因抑制肺腺癌转移是通过抑制及Wnt/β-catenin 信号通路来实现。

表2 裸鼠皮下成瘤实验肿瘤生长情况Tab.2 Tumor growth in subcutaneous tumor formation in nude mice ±s，mm3

表2 裸鼠皮下成瘤实验肿瘤生长情况Tab.2 Tumor growth in subcutaneous tumor formation in nude mice ±s，mm3

注：与第1 周相比，*P ＜0.05

组别LTEP-A-2-空载体（n=4）LTEP-A-2-LHX6（n=4）周数1 周10.5±2.3 11.2±1.7 2 周503.9±42.1*40.6±5.8*3 周1 239.0±156.7*471.7±99.2*4 周2 031.0±341.8*801.5±145.6*

图2 裸鼠皮下成瘤实验结果及肝脏转移情况病理切片图Fig.2 Results of subcutaneous tumor formation and liver metastasis in nude mice

图3 过表达LHX6 基因对肺腺癌细胞迁移及侵袭的影响Fig.3 Effect of overexpression of LHX6 gene on migration and invasion of lung adenocarcinoma cells

3 讨论

肺腺癌是肺癌中常见的病理类型［5］，该疾病易发生早期转移是肺癌难以诊治的根本原因之一，造成患者经济负担重及病死率高。如何有效地预防和抑制肺腺癌转移是肺癌有效治疗的关键因素之一。LHX6（LIM homeobox domain 6）基因是编码LIM 同源域的一类转录因子［6］，前期研究发现LHX6 基因在肺癌中是一个受甲基化调控的基因且具有抑制肺癌细胞增殖和迁移的作用［4］，但其具体的抑制转移机制尚未清楚，因此深入开展该基因抑制肺癌细胞转移的机制研究将为有效治疗肺癌提供新的思路。

图4 Top/Fop Flash 荧光素酶实验结果及Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表达情况Fig.4 Top/Fop flash luciferase test and expression levels of Wnt/beta-catenin downstream gene protein and mRNA

图5 LHX6 过表达抑制β-catenin 蛋白及mRNA 表达Fig.5 LHX6 inhibits the expression of β-catenin protein and mRNA

为明确LHX6 基因在不同肺癌类型中可能有着不同的临床意义，本研究首先通过公共数据库对该基因表达与不同的病理类型肺癌的预后进行了分析，结果发现LHX6 基因高表达可以明显改善肺腺癌患者临床预后，同时该基因与肺腺癌转移明显相关且可以对引起转移的相关基因表达水平造成影响；为验证LHX6 基因具有抑制肺腺癌转移的生物学功能，本研究通过构建裸鼠皮下成瘤实验及LHX6 表达差异肺腺癌细胞株迁移及侵袭实验进行证实，数据显示无论在体内裸鼠皮下成瘤实验还是体外肺腺癌细胞迁移及侵袭实验，均明确显示LHX6 基因过表达后可以明显抑制肺腺癌细胞转移；为进一步探索该基因抑制肺腺癌转移的可能机制，笔者结合前期公共数据库分析结果和Top/Fop Flash 荧光素酶实验结果，推测其抑制转移机制可能为直接抑制Wnt/β-catenin 信号通路实现，为验证推测，本研究对Wnt/β-catenin 通路下游基因Cyclin D1、MMP7、c-Myc表达水平进行了测定，结果发现LHX6 基因过表达后Cyclin D1、MMP7、c-Myc均出现了不同程度的表达下降，最后本研究对βcatenin 蛋白和mRNA 表达情况进行了测定，结果显示LHX6 基因过表达后可以明显降低β-catenin 蛋白和mRNA表达水平，由于β-catenin是细胞粘附连接的重要成分［7］，也是Wnt 信号通路的调节中心［8］，所以笔者有理由认为LHX 基因可以通过直接抑制Wnt/β-catenin 信号通路实现抑制肺腺癌转移。诚然实验条件和经费限制，本研究未进一步开展LHX6 基因与Wnt/β-catenin 信号通路结合位点及使用通道抑制剂后该基因表达情况等诸多问题研究，这也将是未来研究的重点之一。

综上所述，LHX6 基因可以明显抑制肺腺癌转移，其抑制肺腺癌转移是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路影响其下游基因转录而实现。