不同促透剂对根皮素体外透皮吸收的影响

关 波 皇甫俊茹 徐 媛 周雪姣 刘雪英 王庆伟

1.空军军医大学第二附属医院药剂科，陕西西安 710038；2.西安金花制药厂生产部，陕西西安 710065；3.西安市胸科医院药剂科，陕西西安 710075；4.空军军医大学药学系药物化学与药物分析学教研室，陕西西安 710032

根皮素（Phloretin）是一种主要存在于梨、苹果、金橘果皮或根皮及多种蔬菜中的类黄酮化合物[1-2]，其化学结构含有4 个酚羟基，决定了其较强的抗氧化活性[3-5]。研究发现，根皮素具有多种生物学活性，对癌细胞具有抑制作用[6-7]，对皮肤光损伤具有保护作用[8]，对心血管系统、高脂血症和骨质疏松等疾病也具有一定的治疗作用[9-11]。透皮给药可以显著减少药物的首过效应和不良反应，从而使药物以恒定速度透过皮肤进入体内产生药理作用[12-13]。本文拟分别考察氮酮、冰片、薄荷醇、麝香酮4 种促透剂对根皮素透过SD 大鼠皮肤的促透效应，筛选出最优促透剂，为根皮素系列经皮给药制剂研发提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统（Agilent，American；包含Agilent 1260 泵、Agilent 1260 DAD 二极管阵列检测器、Agilent 1260 色谱工作站）；Franz YB-P6智能透皮实验仪（天津标准仪器制造厂）；电子天平（德国Sartorius 公司，精度0.1 mg）；电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度0.01 mg）。

1.2 试剂

根皮素对照品（空军军医大学药化教研室提供，含量99.00%，批号：20170922）；根皮素原料（空军军医大学药化教研室提供，含量98.70%，批号：20170910）；氮酮（天门科捷制药有限公司）；薄荷醇（天津市福晨化学试剂厂）；冰片（天津市登峰化学品有限公司）；麝香酮（湖北梦盛化工）；辛酸葵聚乙二醇甘油酯（法国嘉法师）；生理盐水（西安京西双鹤药业有限公司）；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司，分析纯）；乙腈（美国Tedia 公司，色谱纯）；色谱用超纯水自制。

1.3 实验动物

2 月龄雄性SD 大鼠，18 只，SPF 级别，体重200～220 g，合格证号：37009200001779。购自空军军医大学动物实验中心[许可证号：SCXK（军）2014-007]。自由饮食和进食，室温保持在（25±3）℃。

2 方法与结果

2.1 HPLC 法测定样品中根皮素的含量

2.1.1 溶液的制备 精密称量根皮素对照品5.20 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为520.0 μg/mL 根皮素母液，4℃冰箱中保存待用。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Iinertsil ODS-3（150 mm×4.6 mm，5 μm）；C18保护柱（10 mm ×4.6 mm，江苏汉邦）；流动相：乙腈-水（45∶55）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm，进样量：20 μL，柱温：25℃。

2.1.3 专属性 取适当浓度的根皮素对照品30%乙醇-生理盐水（EPS）溶液、根皮素透皮吸收接收液和甲醇溶液，色谱条件下进样，记录色谱图。结果显示，根皮素色谱峰基线分离完全，tR 为3.8 min，其他成分不干扰根皮素的测定（图1）。

2.1.4 标准曲线制备与线性范围的确定 精密量取根皮素对照品母液适量，用30%EPS 溶液逐步稀释成0.1030、0.5148、2.574、5.148、17.16、34.32、51.48 μg/mL系列溶液。色谱条件下进样，根皮素峰面积Y 对浓度C进行回归，回归方程为：Y=86.45C+3.901（r=0.9999），根皮素在0.1030～51.48 μg/mL 浓度范围内线性关系良好。

图1 根皮素对照品及样品色谱图（根皮素色谱峰）

2.1.5 精密度实验 取浓度分别为0.1030、5.148、51.48 μg/mL 的根皮素对照品30% EPS 溶液，于同一天重复进样5 次，连续3 d，每个样品各进样5 次，计算日内和日间精密度。结果见表1。所有RSD 均＜2.0%，表明该方法的精密度良好。

表1 根皮素测定方法精密度（n=5）

2.1.6 稳定性实验 取根皮素的甲醇和30% EPS 溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24 h，色谱条件下分别测定根皮素峰面积。24 h 峰面积的RSD 分别为0.912%和0.934%（n=5），表明根皮素甲醇和30%EPS 溶液在室温下24 h 内稳定性良好。

2.1.7 加样回收率实验 取12 h 透皮接收液（根皮素含量为15.28 μg/mL）9 份，每份1.0 mL，置于5 mL 量瓶中，分为3 组，每组分别加入根皮素对照品30%EPS溶液（浓度为17.16 μg/mL）0.80、1.00、1.20 mL，加30%EPS 溶液至刻度，摇匀，测定根皮素含量。计算得平均回收率为99.36%。RSD 为1.02%（n=9）。

2.2 透皮吸收实验

2.2.1 皮肤的制备 健康SD 大鼠用乙醚麻醉，剪取剑突以下腹部去毛皮肤。剔除皮下脂肪组织及黏膜，生理盐水冲洗至皮肤洗液不再白色浑浊，滤纸吸干皮肤表面，透过灯光检查皮肤完整性，选取适当大小无损伤的皮肤备用。

2.2.2 药物溶液的制备 30%EPS 溶液中加入Labrasol（含量1.0%），作为基础溶液。取多份适量基础溶液加入根皮素和不同促透剂，根皮素的含量均为30 mg/mL，氮酮、冰片、薄荷醇、和麝香酮的含量分别是0.0%、1.0%、2.0%、4.0%，超声混合均匀后待用。

2.2.3 促透剂促进根皮素透皮吸收实验 设定Franz 扩散池系统温度为（37.0±0.2）℃，搅拌子转速为300 r/min（长度为1.0 cm）。SD 大鼠皮肤角质层向上固定于供药池和接收池之间，接收池中注入30%EPS 溶液，真皮一侧与接收液充分接触。系统温度恒定后，供药池中加入1.0 mL 供试液。恒速搅拌并开始计时，分别于1、2、4、6、8、12 h 抽取接收液1.0 mL，同时补加1.0 mL已预热至37℃的30%EPS 溶液，排净气泡。HPLC 测定接收液样品中根皮素的含量，按下式计算单位面积累计透过量（Qn）：式中，Cn为第n个取样点测得的根皮素浓度（μg/mL）；V 为接收液体积（17.0 mL）；Ci为第i 个取样点测得的根皮素浓度（μg/mL）；Vi为取样体积（1.0 mL）；A 为渗透面积（1.67 cm2）。将Qn对时间t 进行回归，Qn-t 方程斜率即为根皮素的透皮速率常数Jss[μg/（cm2·h）]。根皮素的渗透系数为Kp=Jss/C，C 为供药池的药物浓度；增渗倍数为ER=KP/KP0，KP为加促透剂后根皮素的渗透系数，KP0为根皮素固有的渗透系数。供试液中根皮素浓度相同，故ER 为透皮速率常数之比，即ER=J促透剂组/J对照组。

2.3 结果

2.3.1 氮酮对根皮素的促透结果 不同浓度氮酮对根皮素透过大鼠皮肤均具有不同程度的促进作用，与不含氮酮的对照液比较，随着氮酮浓度的增大，促透效应越强。Qn与时间t 呈较好线性关系，r 值均＞0.92。见表2、图2 和表3。

表2 氮酮促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量（n=3）

图2 氮酮促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量

表3 氮酮作用下根皮素透过大鼠皮肤的动力学参数

2.3.2 薄荷醇对根皮素的促透结果 不同浓度薄荷醇对根皮素透过大鼠皮肤均具有不同程度的促进作用，与不含薄荷醇的对照液比较，随着薄荷醇浓度的增大，促透效应越强。Qn与时间t 呈较好线性关系，r 值均＞0.86。见表4、图3 和表5。

表4 薄荷醇促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量（，n=3）

表4 薄荷醇促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量（，n=3）

2.3.3 冰片对根皮素的促透结果 不同浓度冰片对根皮素透过大鼠皮肤均具有不同程度的促进作用，与不含冰片的对照液比较，随着冰片浓度的增大，促透效应越强。Qn与时间t 呈良好线性关系，r 值均＞0.88。4.0%时冰片的透皮速率相对较大：4.0%>2.0%>1.0%>0.0%。见表6、图4 和表7。

图3 薄荷醇促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量

表5 薄荷醇促根皮素的渗透动力学参数

表6 冰片促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量（，n=3）

表6 冰片促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量（，n=3）

注：“-”表示无数据

图4 冰片促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量

表7 冰片促根皮素的渗透动力学参数

2.3.4 麝香酮对根皮素的促透结果 不同浓度麝香酮对根皮素透过大鼠皮肤均具有不同程度的促进作用，与不含麝香酮的对照液比较，随着麝香酮浓度的增大，促透效应越强。Qn与时间t 呈良好线性关系，r 值均＞0.90。4.0%时麝香酮的透皮速率相对较大：4.0%>2.0%>1.0%>0.0%。见表8、图5 和表9。

表8 麝香酮促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量（，n=3）

表8 麝香酮促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量（，n=3）

图5 麝香酮促根皮素离体大鼠皮肤的单位面积累积透过量

表9 麝香酮促根皮素的渗透动力学参数

3 讨论

根皮素结构中含有多个酚羟基，是亲脂性化合物，易溶于醇类中，在乙醇中有较好的溶解度[14]，为了增加根皮素在供给液及接收液中的溶解度，选择30%EPS 作为实验供给液和接收液的溶剂。氮酮、冰片、薄荷醇、麝香酮4 种促透剂相对于水均为低密度脂溶性物质，不能完全溶于供试溶液中形成均一体系，实验过程中不能与皮肤充分接触，因此在供试液体系中加入表面活性剂Labrasol，发挥其增溶和乳化作用，使供试液为均一体系。

化合物自身的理化性质是影响化合物透过皮肤屏障的关键因素，一般分子量与药物的经皮扩散速度呈负相关，脂水分配系数在lgP 为1～3 时能较好透过皮肤[15]。已有研究表明，根皮素可以改变细胞膜的通透性，也作为渗透增强剂，被广泛用于局部透皮给药制剂中[16]，但根皮素自身透皮吸收较差。促透剂的选择是透皮吸收的关键，本文选择不同促透剂机制的促透剂，考察其对根皮素透皮吸收的促进效应。薄荷醇属于单萜类化合物，研究发现一般在1%～5%范围内其促透效果与剂量呈效应关系，其促透作用随着浓度增大而增强[17]。氮酮能使角质层的类脂质产生不规则排列，增强角质层的流动性，有利于药物透过角质层[18]，冰片的促透机制是提取和扰乱角质层类脂[19]，麝香酮可以选择性改变皮肤阻力问题[20]。

实验考察的四种促透剂对根皮素均有促透皮效应，且促透作用随促透剂的浓度增加而增加，在实验考察的范围内，每一种促透剂浓度为4.0%的促透作用较大。以增渗倍数为指标，促透剂浓度为1.0%时促透效应为薄荷醇>麝香酮>冰片>氮酮；促透剂浓度为2.0%时促透效应为薄荷醇>冰片>氮酮>麝香酮；促透剂浓度为4.0%时促透效应为薄荷醇>氮酮>冰片>麝香酮。结果表明，薄荷醇对根皮素透过皮肤的促进作用最好，其次为冰片和氮酮。但是，冰片和薄荷醇均有强烈的皮肤清凉感，当浓度过大时皮肤难以接受，因此，在制剂研发时有必要依据产品的需求进一步考察合适用量或多个促透剂联合应用。