HP20大孔树脂纯化毛酸浆总黄酮的工艺优化
2019-12-25胡选生李丹青闫小叶
胡选生，李 娜，李丹青，闫小叶，田 欢
(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)
毛酸浆(PhysalispubescensL.)为茄科酸浆属草本植物，别称为洋菇娘、黄菇娘等，其带浆果的宿萼或全草称作灯笼草，药用历史远久[1]。毛酸浆中富含黄酮类类化合物，具有抗肿瘤、消炎、抗氧化、利尿、免疫抑制等生理活性[2]。大孔树脂具有吸附量大、效率高、解吸容易、不溶于酸碱、稳定性较强、比表面积较大、可重复利用、寿命长等优点，是一种有效的分离纯化黄酮方法[3,4]。研究表明HP20大孔树脂对黄酮类物质的分离、富集能力较好[5～7]。目前关于毛酸浆总黄酮分离纯化工艺的研究较少, 研究利用HP20大孔树脂通过单因素和正交试验优化毛酸浆总黄酮的纯化工艺，为毛酸浆总黄酮的进一步开发利用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
毛酸浆购于辽宁省丹东市，干燥粉碎后备用；HP20大孔吸附树脂购于日本三菱化学公司；芦丁标准品购于西安晶博生物科技有限公司; 其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器
DHG-9123A型恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；UV-1100型紫外可见分光光度计(上海美析仪器有限公司)；TS-110X50型恒温振荡器(上海博珍仪器设备制造厂)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；LGJ-10D型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 HP20大孔吸附树脂的预处理 取适量HP20大孔树脂，用95%乙醇浸泡24 h，湿法装柱，用蒸馏水冲洗至无醇味。然后依次用5% HCL、5% NaOH浸泡24 h，除去树脂中碱类、酸类化合物，最后用蒸馏水冲洗至中性，晾干备用[8]。
1.3.2 槲皮素标准曲线的绘制 将槲皮素标准品配制成不同的浓度, 采用硝酸铝显色法显色后于分光光度计的510 nm波长处测吸光度[9,10], 以槲皮素质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，得到线性回归方程y = 4.9737x+0.0036，R2= 0.9989。
1.3.3 毛酸浆总黄酮的制备 称取20 g毛酸浆粉末→95%乙醇提取→ 90℃水浴→合并滤液→旋转蒸发→蒸发至膏状→冷冻干燥。制得毛酸浆总黄酮提取物。
1.3.4 静态吸附单因素试验 主要有:
(1)吸附时间对吸附率的影响。称取HP20大孔树脂6份2 g于100 mL锥形瓶中，加入30 mL pH为6的总黄酮提取液(1 mg·mL-1)，在30℃、120 r·min-1条件下分别振荡吸附4、4.5、5、5.5、6 h，测定溶液中剩余黄酮浓度，按照公式(1)计算吸附率，确定最佳吸附时间。
(1)
式中：E—吸附率，%；
C0—起始液黄酮浓度，mg·mL-1；
C1—吸附后溶液中的黄酮浓度，mg·mL-1。
(2)吸附温度对吸附率的影响。准确称取预处理的6份HP20树脂2 g于100 mL锥形瓶中，每瓶中精密量取30 mL pH为6的总黄酮提取液(1 mg·mL-1)，分别置于20、25、30、35、40℃的恒温水浴摇床上，在120 r·min-1条件下震荡吸附5 h后，根据(1)计算树脂吸附率，确定最佳吸附温度。
(3)样品液pH值的影响。准确称取各2 g HP20大孔树脂于100 mL锥形瓶中，各加入30 mL pH为4、5、6、7、8的总黄酮粗提液(1 mg·mL-1)，于30℃、120 r·min-1条件下震荡吸附5 h后，根据公式(1)计算树脂吸附率，确定样品液的最佳pH值。
1.3.5 静态解吸单因素试验 主要有:
(1)解吸液乙醇体积分数对解吸率的影响。称取HP20大孔树脂2 g于100 mL锥形瓶中，加入30 mL黄酮提取液(1 mg·mL-1)，在30℃、120 r·min-1条件下振荡吸附5 h，测定吸光度值。将吸附后的黄酮提取液倒出，用纯水对树脂进行三次洗涤，除去水分。
称取吸附饱和的大孔树脂2 g，分别加入30 mL体积分数为60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，于在25℃、120 r·min-1条件下解吸3 h，按照公式(2)计算解吸率，确定最佳乙醇体积分数。
(2)
式中：D—大孔吸附树脂的解吸率，%；
C2—解吸24 h后解吸溶液中的总黄酮质量浓度，mg·mL-1；
V1—黄酮溶液体积，mL；
V2—解吸液体积，mL。
(2)解吸液乙醇体积对解吸率的影响。称取吸附饱和的HP20大孔树脂2 g于100 mL锥形瓶中，分别加入60、65、70、75、80 mL的70%乙醇，于在25℃、120 r·min-1条件下解吸3 h，按照公式(2)计算解吸率，确定最佳乙醇体积。
(3)解吸时间对解吸率的影响。称取吸附饱和的HP20大孔树脂2 g于100 mL锥形瓶中，分别加入70 mL的70%乙醇，于在25℃、120 r·min-1条件下解吸2、2.5、3、3.5、4 h，按照公式(2)计算解吸率，确定最佳解吸时间。
1.4 正交试验
在单因素试验基础上，对影响吸附率和解吸率的主要因素进行正交试验, 确定最佳吸附参数和解吸参数。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的制作
图1 槲皮素标准曲线
由图1可知，槲皮素的标准曲线回归方程为y = 0.003x + 0.0143，R2= 0.9983。结果表明槲皮素在 50～250 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 吸附时间对吸附率的影响 如图2所示：在5 h之前吸附率随时间增加变化较大, 之后基本保持不变, 表明吸附达到平衡，因此选择吸附时间为4.5、5、5.5 h进行正交设计试验。
图2 吸附时间对吸附率的影响
2.2.2 吸附温度对吸附率的影响 由图3可知，当温度从20℃上升至40℃，吸附率呈现先逐渐升高后降低的趋势，当温度为30℃ 时，树脂的吸附率最大，可达90.2%。因此选择吸附温度为25、30、35 ℃进行正交设计试验。
图3 吸附温度对吸附率的影响
2.2.3 样品液的pH对吸附率的影响 如图4所示：当样品液的pH从3到6时，树脂吸附率呈上升趋势，当样品液的pH为6时吸附率已经到最高，再随着样品液pH的增长，解吸率下降。当pH较高时，黄酮酚羟基分离H+，氢键相互作用减少，从而导致出现较低的吸附能力[11]。因此选取样品液的pH为5、6、7进行正交设计试验。
图4 样品液的pH对吸附率的影响
2.2.4 乙醇体积分数对解吸率的影响 如图5所示：当乙醇体积分数从60%增长到70%时，解吸率逐渐上升。即乙醇体积分数上升到70%时，解吸率呈现出最大，之后随着乙醇体积分数的增加，解吸率下降。可能是由于乙醇体积分数的增加会减少其中的水分含量，从而导致一些水溶性黄酮类物质不能被溶解[12]。因此选取乙醇体积分数分别为65%、70%、75%进行正交设计试验。
图5 乙醇体积分数对解吸率的影响
2.2.5 乙醇体积对解吸率的影响 如图6所示：随着洗脱液体积的增加，解吸率逐渐上升，当解吸液体积增加到70 mL时，解吸率达到最高值，之后逐渐趋于平缓。因此选取解吸液体积为65、70、75 mL进行正交设计试验。
图6 乙醇体积对解吸率的影响
2.2.6 解吸时间对解吸率的影响 如图7所示：在3 h之前解析率随时间增加而增加，之后基本保持不变，表明解吸完全。因此选取解吸时间为2.5、3.0、3.5 h进行正交设计试验。
2.3 正交试验
正交试验的因素和水平见表1, 表2；正交试验设计及结果见表3，表4。
表2 大孔树脂解吸毛酸浆总黄酮工艺正交试验因素水平
由表3可知，根据R值大小, 得出因素影响的主次顺序为吸附时间>吸附温度>样品液pH值。正交试验的最优组合为A2B2C2, 即吸附时间为5 h，吸附温度为30℃，样品液的pH为6。验证试验结果表明，A2B2C2工艺条件下的吸附率为88.4%。
由表4可知，根据R值大小, 得出因素影响的主次顺序为乙醇体积分数>乙醇体积>解吸时间。正交试验的最优组合为A2B2C2, 即乙醇体积分数70%，乙醇体积70 mL，解吸时间3 h。验证试验结果表明，A2B2C2工艺条件下的解吸率为90.2%。
表3 大孔树脂吸附毛酸浆总黄酮工艺正交试验设计及结果
表4 大孔树脂解吸毛酸浆总黄酮工艺正交试验设计及结果
3 结论
HP20型大孔吸附树脂能够纯化毛酸浆总黄酮，最佳吸附工艺条件为吸附时间5 h，吸附温度30℃，样品液的pH6。此工艺条件下的吸附率为88.4%；最佳解吸工艺条件为乙醇体积分数70%，乙醇体积70 mL，解吸时间3 h，此工艺条件下的解吸率为90.2%。该工艺为制备毛酸浆总黄酮、深度开发毛酸浆提供了一定的参考依据。
