正交法优选木贼山奈素水解条件的研究

胡玲玲

(安康学院 化学化工学院，陕西 安康 725000)

木贼(Equisetumhiemale):木贼科(Equisetaceae)木贼属多年生草本植物的干燥地上部分，又名千峰草、笔头草、节骨草等,为较常用的中药材，分布于中国东北、华北、西北、西南及湖南、河南、湖北[1～5]。迄今为止，木贼科植物已发现有30多种，而木贼是《中国药典》2000年版收载的品种，也是现今木贼属唯一被药典载入的植物[6]。其味甘、苦，性平，主要作用于肺经、肝经。具有祛风散热、明目眼睛、清除白内障的功效。常用于治疗风热感冒、红眼病、白内障，迎风流泪等症状。据药理研究表明，木贼还对心血管系统有很好的保护、修复作用[7]，能抗氧化、抗衰老[8、9]和保肝、镇痛作用[8]，主要是因木贼中含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类化合物对于治疗疾病起着很重要的作用。山奈素属于黄酮醇类，与黄酮类化合物具有相同的母核，且在木贼中山奈素为主要成分，故本实验可用山奈素作为指标性成分[9]。山奈素的系统命名为：3,5,7-三羟基-4、-甲氧基黄酮，结构式如图1。

图1 山奈素的结构式

目前，测定植物黄酮类化合物含量的主要检测方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、双波长薄层扫描法等方法[10]。由于紫外分光光度法具有准确、操作简单的特点[10]，且正交优选水解条件的实验测试数据多，没必要使用太过复杂的仪器或设备辅助。故笔者实验拟采用以山奈素为指标性成分，通过紫外分光光度法测定山奈素含量，以此来比较木贼山奈素的最佳水解条件。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

实验所用主要仪器见表1。

1.2 试剂与样品(表2)

表1 实验仪器与设备

表2 实验试剂与样品

2 实验方法与结果

2.1 山奈素标准溶液的制备

用分析天平精确称取2.10 mg的山奈素对照品，加少量无水甲醇[9]溶解，转移到25 mL的容量瓶中，甲醇加至刻度线，摇动使其混合均匀，既得山奈素标准溶液，其质量浓度为84 μg·mL-1，置冰箱中备用。

2.2 供试品溶液的制备

将木贼样品粉碎，过40目筛，精密称取0.75 g，共9份，分别放置于50 mL具塞的圆底烧瓶中，加入75%乙醇25 mL并进行称重，连通球形冷凝管，用水浴锅加热回流，放冷后再次称重，用75%的乙醇补足损耗的乙醇，摇匀过滤，量取滤液10 mL，加入浓盐酸，进行水解。水解液水浴蒸干，残渣加10 mL蒸馏水溶解后倒入60 mL分液漏斗中，用10 mL乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，水浴使乙酸乙酯蒸干，将剩余残渣部分用甲醇溶解多次少量溶解并转移至5 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得木贼山奈素供试品溶液[6]。

2.3 最大吸收波长的选择和标准曲线绘制

2.3.1 最大吸收波长的选择 分别精密量取质量浓度为84 μg·mL-1的山奈素标准溶液和山奈素供试品溶液各2 mL，甲醇溶液定容到5 mL的容量瓶中，得山奈素对照品溶液。打开L-5S紫外分光光度计，预热30 min，取制得的山奈素对照品溶液，以无水甲醇为空白溶液调零，进行全波长扫描，根据山奈素对照品溶液的最大吸收波峰，确定测定山奈素供试品液的最大吸收波长[10～13]。由波长扫描得，不管是山奈素对照品溶液，还是木贼山奈素供试品溶液，都在波长365nm处有最大吸光度，呈现最大吸收峰，故选择波长365 nm为实验的测定波长。

2.3.2 标准曲线绘制 用移液管精密量取84 μg·mL-1的山奈素标准溶液0.20 mL，0.40 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用无水甲醇稀释至刻度线，制得1.68 μg·mL-1，3.36μg·mL-1，5.04μg·mL-1，6.72 μg·mL-1，8.40 μg·mL-1系列浓度的山奈素对照品溶液。以甲醇作为空白对照[10～13]，在最大吸收波长下，用紫外分光光度计测定其吸光度，并准确记录数值。绘制山奈素标准曲线时，纵坐标为测定的吸光度(A)，横坐标为山奈素对照品溶液的质量浓度( μg·mL-1)[13]。进行回归分析，得其回归方程为y = 0.0828x - 0.0017， r =0.9992。木贼山奈素含量在1.68～8.40 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4 木贼山奈素水解条件的正交设计

根据前期查阅文献和预实验预情况[10～13]，采用正交实验设计，安排三个因素：水解时间(min)、水解温度(℃)和加入浓盐酸的量(mL)，每个因素设置3个水平。用L9(34)正交表进行正交实验 ，各因素水平见表3。

表3 木贼山奈素水解条件因素水平

2.5 木贼山萘素含量测定

精密量取2.2中制备的木贼山奈素供试品溶液1 mL转移至50 mL容量瓶中，加75 %甲醇溶解至刻度线，摇匀。在最大吸收波长下测定其吸光度，将吸光度平均值带入标准曲线方程，计算得出的数值即为山奈素供试品溶液的质量浓度。测定的结果及正交分析见表4和表5。由R值可知，各个因素对木贼山萘酚提取时的影响 ：加浓盐酸量>水解时间>提取温度，且C2>C1>C3，A1>A2>A3，B2>B3>B1，由此可见水解最佳条件为A1B2C2。表5的方差分析表中C因素的(加盐算量)F0.05

2.6 重复性实验

由于正交实验优选出的工艺路线(A1B1D2)不在实验设计方案中，因此需进行实验验证。称3份木贼粉，按优选出的水解条件制备供试品溶液，结果见表6。

由表6可知，此条件下木贼山奈素的含量在5.721～6.248 ug·mL-1,平均含量为6.092 ug·mL-1。与实验2方案(A1B2C2)的含量接近。说明优选出的工艺路线(A1B1D2:加盐酸2.5 mL、60℃水解30 min)是木贼山萘素稳定、合理、可行的水解条件。

表4 山奈素水解条件L9(34)正交试验结果

注：D为空白项。

表5 山奈素水解条件方差分析

F(2、4)0.05=19，F(2、4)0.01=99。

表6 木贼山奈素的含量测定结果 (n=3)

3 讨论

实验在提取木贼山奈素时考虑到提取溶剂甲醇毒性大，因而改用75%乙醇进行提取，通过前期的预实验进行了考察，发现75%的乙醇提取完全，得到木贼山奈素含量较高。且乙醇毒性小，因此最终采用75%的乙醇提取样品。在测定各因素水平木贼山奈素含量时，紫外分光光度法测得的一系列结果一致程度好，具有准确、操作简单的特点。故笔者实验采用以山奈素为指标性成分，通过紫外分光光度法测定山奈素含量，以此来比较优选木贼山奈素的最佳水解条件。