精神依赖物(海洛因)对胚胎大鼠形态结构发育和小脑c-Fos基因表达的影响

谢明仁, 管海彦, 卢建珍, 俞发荣

精神依赖物(海洛因)对胚胎大鼠形态结构发育和小脑基因表达的影响

谢明仁, 管海彦, 卢建珍, 俞发荣*

甘肃政法大学公安技术学院，甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室, 兰州 730070

为了探讨精神依赖物海洛因对胚胎大鼠形态结构发育和小脑表达的影响, 将受孕后的Wistar大鼠40只, 随机分为对照组、海洛因低、中、高剂量组, 每组10只孕鼠。于第7天时, 分别给予32.5、65 和130 mg·kg-1的海洛因, 连续9 d, 观察该物对胚胎大鼠形态结构发育的影响, 用免疫组化法检测胚胎大鼠小脑组织基因表达水平。结果发现, 海洛因低、中剂量组活胚胎总数比对照组分别减少15.87%和29.37%;海洛因低、中剂量组出现了多指, 脐疝, 双耳、肋骨、腰椎骨、前肢掌骨、脑发育不全等畸形胚胎; 高剂量组孕鼠未见成型的胚胎。海洛因低、中剂量组胚胎小脑皮层中表达水平(IOD)比对照组分别增加了48.94%和95.74%(<0.01)。结果表明, 精神依赖物海洛因能通过母体干扰胚胎表型和组织器官的发育, 诱导胚胎小脑组织细胞基因表达, 损伤脑组织细胞的发育。

海洛因; 胚胎发育;

0 前言

精神依赖物(海洛因)滥用已成为严重危及人类健康并为全球所关注的公共卫生问题[1]。统计表明, 近年来, 我国吸食毒品的人群中, 青少年呈快速上升趋势, 其中大多是15—30岁的青少年; 同时, 女性吸毒人数呈上升趋势[2], 约占全部吸毒者20%—30%, 她们多为育龄妇女或将要进入育龄期的妇女, 其平均年龄集中在育龄期范围。海洛因在引起母体损伤的同时, 可迅速通过胎盘屏障和胚胎血脑屏障, 对胎儿产生直接的影响[3]。有关精神依赖物(海洛因)对胚胎表型结构发育及对小脑组织发育的毒性作用的报道较少。本文在前期研究的基础上, 以Wistar大鼠为实验对象, 建立海洛因孕鼠模型, 在大鼠胚胎发育期给予不同剂量的海洛因, 观察海洛因对胚胎大鼠组织器官发育和小脑皮质中基因表达水平的影响, 以期为进一步研究精神依赖物(海洛因)的遗传毒性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物: 健康性成熟Wistar大鼠90只(雌60只, 雄30只), 体重200—210 ｇ, 购于甘肃中医药大学科研实验中心[SCXK(甘)2015—0001], 实验在甘肃政法大学SPF级动物实验室完成[SYXK (甘)2015—0006]。实验按3R原则给予实验动物伦理关怀。

药品: 海洛因, 含量86.8%, 其余成分为葡萄糖, 甘肃省公安厅提供; 2, 4, 6—三硝基酚、氢氧化钾、甘油、水合氯醛、茜素红、葡萄糖, 购于甘肃省化玻试剂公司; OLYMPUS—CX31型生物显微镜(日本); YA—G5000系列医学细胞影像分析软件; 兔抗、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒, 购于武汉博士德生物工程有限公司; EDTA液, 购于北京中杉生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠培育、分组和给药

全部大鼠适应环境7 d, 按雌: 雄=2: 1合笼饲养, 合笼后次日早晨作阴道精子涂片检测, 有精子者为已交配, 当日作为“受孕”零天。将检出的“孕鼠”随机分为4组, 每组10只孕鼠。海洛因高、中、低剂量组: 分别肌肉注射海洛因130、65 和 32.5 mg·kg-1的海洛因;对照组: 肌肉注射生理盐水2 mL·kg-1体重, 各组均从受孕第7天开始给药, 连续9 d。

1.2.2 胚胎子鼠组织结构发育观察

受孕第20天, 用乙醚吸入麻醉大鼠, 解剖开腹腔, 全切取子宫检查吸收胎、死胎及活胎数, 并对胎鼠进行体表形态检查; 每胎取2只活胎仔做透明骨骼标本。透明骨骼标本制法: 参照《毒理试验方法学》文献方法制作, 用透射光源在体视显微镜下检查骨骼。

1.2.3 胚胎仔鼠小脑免疫组织化学染色

剥取胚胎仔鼠小脑组织, 用4%多聚甲醛—1.25戊二醛—磷酸缓冲液(pH7.4)固定24 h, 常规脱水: 75%乙醇2 h→85%乙醇2 h→95%乙醇1 h→95%乙醇1 h→100%乙醇1 h→100%乙醇1 h→二甲苯1 h→二甲苯1 h。石蜡包埋, 切片, 片厚5 mm。脱蜡: 二甲苯10 min→二甲苯10 min。梯度乙醇复水: 100%乙醇5 min→95%乙醇5 min→80%乙醇5 min。孵育前用微波处理进行抗原修复, 一抗置4℃冰箱孵育48 h, 对照组用PBS代替一抗, DAB显色, 苏木素复染, 光镜观察, 显微拍照并进行图像分析。

1.2.4 图像分析和统计学处理

用YA—G5000系列医学细胞影像分析软件进行图像拍照及其分析。从每组免疫组织化学切片中各选5张形态典型对应切面, 测量积分吸光度(IOD)、平均吸光度(AOD)。

2 结果

2.1 海洛因对胚胎发育的影响

受孕第20天解剖结果发现, 海洛因低、中剂量组活胚胎总数比对照组分别减少15.87%和29.37%, 海洛因高剂量组孕鼠未见成型的胚胎。见表1, 图1。

2.2 海洛因对胚胎表型发育的影响

观察发现, 海洛因低、中剂量组胚胎出现了多指(右后肢多2指)1例、脐疝1例、卷尾1例、双侧耳发育不全1例, 腹裂1例、脊柱侧弯2例、无耳2例、眼球突出1例、颜面裂1例、下颚裂1例、枕骨裂脑膨出2例; 海洛因高剂量组孕鼠未见成形胚胎。见图2。

2.3 海洛因对大鼠胚胎骨骼发育的影响

透明骨骼标本观察发现, 海洛因低、中剂量胚胎出现枕骨发育不全, 肋骨、腰椎骨、四肢骨发育不全, 尾骨与骶骨脱离, 椎骨裂开, 未骨化; 海洛因高剂量组孕鼠未见成形胚胎。见图3。

2.4 海洛因对胚胎小脑皮层中c—Fos基因表达水平的影响

光镜观察发现, 海洛因低、中剂量组阳性细胞分布密集, 胞体着色深, 胞质和胞核均有表达。细胞影像分析, 海洛因低、中剂量组胚胎小脑皮层中表达水平(IOD)比对照组分别增加了48.94%和95.74%, 与对照组相比差异有显著性(<0.01); 海洛因高剂量组孕鼠未见成形胚胎。见表2。

3 讨论

有研究表明, 精神依赖物(海洛因)不但影响吸食者的身心健康[4], 还严重影响胚胎发育[5], 影响胚胎出生后幼体的生长发育。海洛因成瘾不仅导致大脑内有关神经核团诱导反应的急剧增加, 直接损害神经元、星形胶质细胞以及血脑屏障的通透性改变[6], 而且导致海洛因依赖者更大区域大脑损伤和脑功能异常的持续影响[7]。临床研究表明: 孕妇吸毒1 h后, 在胎儿体内测出有海洛因代谢产物吗啡存在。海洛因可直接作用于胚胎发育的各个时期, 导致胚胎组织器官发育不全或畸形[8]。动物实验发现, 给予孕小鼠不同剂量的海洛因, 母鼠及胚胎仔鼠肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶 (CAT)活力明显降低, 丙二醛(MDA)含量显著升高, 肺组织结构出现了明显的病理性损伤[9]。王园园等[10]研究发现, 孕期使用毒品可影响胎儿大脑的正常发育, 导致脑内神经递质系统异常以及行为的改变, 从而导致子代的学习记忆和成瘾易感性等行为异常[11]。海洛因成瘾不仅影响胚胎正常发育,出现宫内死胎、流产、早产, 增加新生儿及婴儿死亡的概率[12], 还使子代表观遗传性发生改变[13]。属于快速早期基因是存在于正常神经元细胞核内的快速反应基因, 可在数分钟内对外界刺激作出反应并进行表达, 是联系细胞生化改变与细胞最终对刺激发生特异性反应的中介物。基因的表达产物蛋白被作为神经元活动变化和伤害性的标志。当母体受到外界环境刺激, 如缺氧、缺血[14]时, 胎儿脑组织内蛋白的表达明显升高[15]。一旦表达, 必将通过调控下游靶基因来影响细胞内蛋白酶、受体、细胞因子等的表达, 从而引起细胞功能代谢紊乱, 最终导致组织器官表型的改变。实验结果表明, 给予孕鼠海洛因后, 胚胎表型、骨骼发育均受到干扰, 小脑组织细胞表达显著增强, 从分子生物学角度证明了海洛因能通过母体干扰胚胎表型和组织器官的发育, 诱导胚胎小脑组织细胞c—Fos基因表达, 损伤脑组织细胞的发育, 有关海洛因影响胚胎发育的其它分子机制尚需进一步探讨。

表1 海洛因对大鼠胚胎发育的影响

注： 1: 对照组胚胎; 2: 海洛因低剂量组胚胎; 3: 海洛因中剂量组胚胎; 4: 海洛因高剂量组胚胎。

图1 海洛因对胚胎发育的影响

Figure 1 Effect of heroin on embryonic development

注: 1, 2: 海洛因低剂量组, 胚胎耳、颅骨、后肢趾发育不全; 3, 4, 5: 海洛因中剂量组, 胚胎耳、颅骨、前后肢及趾骨发育不全, 颅脑膨出。

Figure 2 Effects of heroin on embryonic organ development

注: 1: 对照组胚胎骨骼; 2, 3: 海洛因低、中剂量组胚胎骨骼, 胚胎颅骨、肋骨、前后肢及趾发育不全。

Figure 3 Effect of heroin on embryonic skeletal development

表2 海洛因对胚胎小脑皮层中c-Fos基因表达水平的影响(±s)

注： 与对照组比:**<0.01。

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Effects of spiritual dependence (heroin) on morphological structure development andexpression in cerebellar cortex of embryonic rats

XIE Mingren, GUAN Haiyan, LU Jianzhen, YU Farong*

School of Public Security Technology, Gansu University of Political Science and Law, Key Laboratory of Evidence of Science and Technology Research and Application, Lanzhou 730070, China

To investigate the effects of spiritual dependence(heroin) on morphological structure development andexpression in cerebellar cortex of embryonic rats, the pregnant Wistar rats were randomly divided into control group and heroin drug group(divided into low, medium and high dose heroin groups).On the 7th day after conception, Wistar rats were treated with32.5, 65 and 130 mg·kg-1heroin for 9 d. The effects of spiritual dependence(heroin) on the morphological and structural development of embryonic rats were observed. Theexpression level in cerebellar cortex of embryonic rats was determined by immunohistochemical staining. The results showed that low, medium dose heroin groups, the total number of live embryos decreased by 15.87 % and 29.37 % respectively, compared with the control group. Multiple fingers, umbilical hernia, two ears, ribs, lumbar vertebrae, and forelimb metacarpal bone dysplasia occurred in low and medium dose groups of heroin; in high dose group of heroin no embryo was formed in pregnant rats. Cell imaging and immunohistochemical tests showed thatexpression level(IOD) was increased by 48.94 % and 95.74 %, respectively, in the cerebellar cortex of low and middle dose groups of heroin, compared with the control group(<0.01). The results showed that spiritual dependence(heroin) inhibits the morphological development and cerebellarexpression level in embryonic rats, and the inhibition increases with the increase of the dose to heroin.

heroin; embryonic development;

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.06.020

Q954.4

A

1008-8873(2019)06-136-04

2019-02-19;

2019-08-25

甘肃省自然科学基金项目(17JR5RA158);甘肃省高校科技创新团队项目(编号: 2016C—09);兰州市科技计划项目(2015—3—80);兰州市人才创新创业项目(2016—RC—85); 甘肃政法学院重点项目(GZF2014XZDLW17)。

谢明仁(1977—), 男, 甘肃民勤人, 硕士, 副教授, 主要从事证据科学技术研究与教学, E-mail: Xmr6700@gsli.edu.cn.

俞发荣, 男, 博士, 研究员, 主要从事法医生物学、药理学和毒理学实验及实验动物学研究, E-mail: tim9898@163.com

谢明仁, 管海彦, 卢建珍, 等. 精神依赖物(海洛因)对胚胎大鼠形态结构发育和小脑基因表达的影响[J]. 生态科学, 2019, 38(6): 136-139.

XIE Mingren, GUAN Haiyan, LU Jianzhen, et al. Effects of spiritual dependence (heroin) on morphological structure development andexpression in cerebellar cortex of embryonic rats[J]. Ecological Science, 2019, 38(6): 136-139.