转基因抗虫玉米CM8101对根际土壤主要理化性质和功能酶活性的影响
2019-12-24梁晋刚栾颖宋新元张正光
梁晋刚，栾颖，宋新元，张正光*
(1.南京农业大学 植物保护学院，江苏 南京 210095； 2.农业农村部科技发展中心，北京 100176; 3.吉林省农业科学院 农业生物技术研究所，吉林 长春 130033)
自从1996年转基因作物开始商业化种植以来，抗虫、抗病、抗逆境、耐除草剂和品质改良等转基因作物相继问世，有效地缓解了人口膨胀、资源短缺、天气恶劣等影响粮食产量的问题，也使全球的农民从中收获巨大的经济收益，但转基因作物的安全问题一直被人们密切关注，尤其是转基因作物对土壤生态系统存在的潜在影响[1-3]。
转基因作物可通过其凋落物残体或根际分泌物等影响土壤理化性质(如土壤含水量、pH值)、微生物群落结构及功能酶活性(如脲酶、磷酸酶)，从而在一定程度上对土壤生态系统中的生物化学反应进程产生影响[1,4-5]。因此，研究转基因作物的种植对土壤主要理化性质和功能酶活性的影响对于完善转基因作物环境安全评价体系具有重要意义[2]。
培育新型抗虫转基因玉米，对于延缓害虫抗性、提高玉米产量、增加农民收入具有重要意义。利用植物的偏好密码子，重新设计和改造Cry1Ab基因并获得新型抗虫基因Cry1Ab-Ma，采用农杆菌介导法将Cry1Ab-Ma基因转入玉米郑58中，获得的转基因玉米CM8101具有较好的抗虫性[6-7]。已有研究表明，转基因玉米CM8101对白符跳的存活率，赤子爱胜蚓的存活率、体重变化量、蚓茧量和孵化幼蚓量均无显著影响[8]。本文对转基因抗虫玉米CM8101根际土壤主要理化性质和功能酶活性进行了2年的监测，以期为转基因抗虫玉米CM8101的环境安全性提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试验材料为转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米CM8101(CM)和非转基因对照玉米郑58(CMCK)，2种试验材料均由研发单位中国农业科学院作物科学研究所提供。
1.2 试验设计及土壤采集
试验时间为2017—2018年，试验地点位于吉林省农业科学院转基因植物环境安全研究试验圃。采用随机区组设计，每个品种设置3次重复。试验期间采用当地普通农事管理操作。
2年的土壤样品都在苗期(SS)、花期(FS)和成熟期(MS)3个生育期采集，3次采样时间均为每年的6月10日、7月15日、10月10日左右。采用五点取样法，每个小区随机选取5个点(不同生育期的取样点保持一致)，去除表层土后将作物根部上的土抖落作为根际土均匀地混在一起，然后用四分法取土，过2 mm筛子后放自封袋于-20 ℃保存以待后续研究[2]。
1.3 土壤主要理化性质的测定
1.3.1 土壤含水量的测定
土壤含水量使用烘干称重法测定[9]。将采集的新鲜土样放在105 ℃的烘箱里烘干至恒重，再用公式计算含水量：含水量=(湿土质量-干土质量)/干土质量×100%。
1.3.2 土壤pH的测定
土壤的pH利用电极法来测定[10]。先称取10 g风干土样和25 mL蒸馏水于100 mL三角瓶中，充分摇匀后静置30 min后，再用pH计测定土壤悬液的酸碱度。
1.4 土壤主要功能酶活性的测定
1.4.1 土壤脲酶活性的测定
利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素后产生的NH3-N，来测定土壤脲酶的活性。土壤脲酶活性的测定采用Solarbio公司的土壤脲酶活性测定试剂盒(货号：BC0125)。活性单位的定义：每天每克土壤中产生1 μg NH3-N定义为1个酶活单位。
1.4.2 土壤酸性磷酸酶活性的测定
利用可见分光光度法，通过酸性磷酸酶催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，测定酚的生成量可以计算出土壤酸性磷酸酶的活性。土壤酸性磷酸酶活性的测定采用Solarbio公司的土壤酸性磷酸酶活性测定试剂盒(货号：BC0140)。活性单位的定义：37 ℃中每克土壤每天释放1 nmol酚为1个酶活单位。
1.5 数据分析
所有数据通过SPSS17.0软件进行统计分析，多处理间差异采用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan氏多重比较。另外，在不同生育期、不同品种间、不同种植年份间，选择单因素方差分析对土壤主要理化性质和功能酶活性进行差异显著性分析[1]。
2 结果与分析
2.1 土壤主要理化性质的变化
如图1所示，2017年和2018年转基因玉米CM8101(CM)根际土壤在3个生育期的含水量与非转基因玉米郑58(CMCK)对比，没有显著性差异；如图2所示，2017年和2018年转基因玉米CM8101根际土壤在3个生育期的pH值与非转基因玉米郑58对比，没有显著性差异。
A—2017年；B—2018年。同生育期柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2～4同。图1 转基因玉米CM8101和郑58根际土壤含水量
通过ANVOA分析可以看出(表1)，2年中不同的玉米品种对含水量和pH均无显著性影响；不同的生育期和年份会显著性地影响到含水量和pH值，其中，含水量在不同年份间的F值为29.782、P值为0.000，pH值在不同年份间的F值为9.958、P值为0.003。但在2017年，pH值在各生育期间无显著性差异。进一步说明转基因抗虫玉米CM8101的种植对根际土壤的含水量和pH值均无显著性影响，并且发现不同种植年限和作物生育期是影响根际土壤主要理化性质的主要因素。
2.2 土壤主要功能酶活性的变化
如图3所示，2017年和2018年转基因玉米CM8101(CM)根际土壤在3个生育期的脲酶活性与非转基因玉米郑58(CMCK)对比，没有显著性差异；如图4所示，2017年和2018年转基因玉米CM8101根际土壤在3个生育期的酸性磷酸酶活性与非转基因玉米郑58对比也都没有显著性差异。
图2 转基因玉米CM8101和郑58根际土壤pH值
表1 含水量、pH值与年份、生育期和品种的ANOVA比较分析
注：*表示达显著水平(P<0.01)。表2同。
通过ANVOA分析可以看出(表2)，2年中不同的玉米品种对脲酶和酸性磷酸酶活性均无显著性影响；不同的年份会显著性地影响脲酶和酸性磷酸酶活性，其中，脲酶在不同年份间的F值为137.631、P值为0.000，酸性磷酸酶在不同年份间的F值为39.294、P值为0.000。进一步说明转基因抗虫玉米CM8101的种植对脲酶和酸性磷酸酶活性均无显著性影响，并且发现不同种植年份是影响根际土壤主要功能酶活性的主要因素。
图3 转基因玉米CM8101和郑58根际土壤脲酶活性
图4 转基因玉米CM8101和郑58根际土壤磷酸酶活性
表2 酶活性与年份、生育期和品种的ANOVA比较分析
3 讨论
转基因作物的种植对土壤生态系统的影响尚无定论，而土壤又是植物、土壤动物、土壤微生物等物质交换和能量流动的重要场所。本文以转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米CM8101和对照非转基因玉米郑58为试验材料，进行了为期2年的田间试验，采集根际土壤样品后测定了3个生育期的主要理化性质(含水量和pH值)和功能酶活性(脲酶和酸性磷酸酶)，结果表明，转基因抗虫玉米CM8101的种植不会对土壤主要理化性质和功能酶活性产生显著性影响，且在已知范围内发现不同生育期和种植年份是影响土壤主要理化性质和功能酶活性的主要因素。本文研究结果为转基因抗虫玉米CM8101的环境安全性提供了可靠数据支持。
3.1 转基因抗虫玉米CM8101种植对土壤主要理化性质的影响
土壤理化性质是评价土壤质量的关键指标[11]，然而在种植转基因作物后，其根系分泌物或其外源物质在土壤中残留，都可能会改变土壤理化性质。已有的研究表明，转基因抗虫水稻华恢1号的种植对土壤pH值无显著性影响[12]；转Bt基因水稻(克螟稻)根系分泌物中有机酸(主要为酒石酸)的含量显著降低，导致作物根系土壤pH值显著性升高[13]；转入木质素过氧化物酶和α-淀粉酶基因后的紫花苜蓿会产生非预期效应，降低枝叶重量、提高氮和磷的含量，进而其种植会导致土壤pH值升高[14]；我们此前的研究发现，转基因高蛋氨酸大豆ZD91和转基因抗虫玉米IE09S034的种植对土壤含水量和pH值均无显著性影响[1-2]。因此，转基因作物的种植对土壤主要理化性质的影响，应当采取个案分析的原则，具体问题具体分析。
3.2 转基因抗虫玉米CM8101种植对土壤主要功能酶活性的影响
已有的研究表明，转基因抗虫耐草甘膦大豆ZB对土壤碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性无显著影响[15]；转Bt基因水稻种植后会导致土壤脲酶活性发生显著性变化，变化幅度受土壤类型和生育期的影响[16]；转Bt基因玉米种植前期会显著性提高脲酶的活性，后期与非转基因玉米的脲酶活性相比没有显著性差异，对磷酸酶活性一直没有显著性差异[17]；转入木质素过氧化物酶和α-淀粉酶基因后的紫花苜蓿会产生非预期效应，降低枝叶重量、提高氮和磷的含量，进而其种植会导致磷酸酶的活性降低[14]；转Bt基因水稻的残体对土壤磷酸酶活性没有显著性影响[18]；我们此前的研究发现，转基因高蛋氨酸大豆ZD91和转基因抗虫玉米IE09S034的种植对土壤蔗糖酶、碱性磷酸酶、脲酶活性均无显著性影响[1-2]。土壤中包含了多种多样的酶，研究时有必要选取具有代表性的酶进行分析。
