附子理中汤治疗胃溃疡的药效机制探讨

黄家望，谢希，陈平安，袁娉，廖灿，刘俊杰，李玲*

(1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208； 2.湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208; 4.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208)

胃溃疡主要是指胃黏膜被胃消化液自身消化造成的超过黏膜肌层的组织损伤，是发生于贲门与幽门之间的炎性坏死病变，是消化性溃疡中最常见的一种，其表现为中央部位炎性坏死和典型水肿[1]。其主要机制与水液代谢的动态平衡密切相关。无水乙醇等化学因素所致的急性胃损伤模型伴有细胞内外特征性水肿反应[2-3]。AQP1、AQP3、AQP4可通过促进细胞连接的动态调节对伤口进行修复[4]，是人体胃组织中主要表达的水通道蛋白[5]。附子理中汤由附子、人参、干姜、甘草、白术组成。附子理中汤在临床主要用于“脾阳虚”等相关疾病的治疗，但未见其对胃溃疡药效机制研究。实验过程中我们发现，模型组溃疡周围见水肿，正常对照组大鼠未出现水肿，而附子理中汤水煎液灌胃后能显著改善大鼠胃溃疡水肿。基于此，推测附子理中汤抗胃溃疡的作用机制可能与调节水液代谢平衡相关。因此，本实验拟在前期研究的基础上，进一步研究附子理中汤对大鼠水通道蛋白基因表达的影响，从水液代谢途径探讨附子理中汤抗食醋诱导的胃溃疡的作用机制。

1 实验材料

1.1 主要仪器

台式高速冷冻离心机(美国Thermo)，净化工作台(吴江净化，YJ-875A)，超微量分光光度计(德国IMPLEN)，实时定量PCR仪(美国Bio-RadFX Connect)，微量移液器(德国eppendorf)、石蜡切片机(美国A0820)。

1.2 主要试剂

1.2.1 糯米白醋

莱阳鲁花醋业食品有限公司生产，生产日期为2018年5月28日，保质期24个月，食品生产许可证编号为SC10337068208749。

RT-PCR检测相关试剂Trizol(Invitrogen)，逆转录试剂盒(promega，A3500)，qPCR mix(promega,A6001)，AQP1、AQP3、AQP4引物(生工)。

1.3 实验动物

200 g左右SD雄性大鼠20只，由斯莱克景达动物公司提供，动物质量合格证号SYXK(湘)2013-0005。

1.4 实验药品

药物均购自湖南中医药大学附属第一医院，按动物体表面积剂量换算法，用双蒸馏水制备大鼠临床等效剂量的各药物水溶液。见表1。

表1 药物说明及小鼠临床等效用量

2 研究方法

2.1 食醋干预大鼠胃溃疡模型建立与实验分组干预

将大鼠随机分为空白组和食醋灌胃组，禁食4 h、禁水1 h后，以食醋灌胃建模，1.5 mL/(100 g·d)，连续灌胃5 d，灌胃后1 h恢复饮食饮水，食醋造模最后一天灌胃完后将食醋灌胃组随机分为空白组、模型组、雷尼替丁组、附子理中汤组。

表2 实验分组与干预方式

2.2 指标检测

2.2.1 一般情况

末次给药后，大鼠禁水禁食8 h，处理动物。常规记录大鼠一般情况和体质量，分离脾脏、胃脏并称重。

2.2.2 HE染色法观察大鼠胃肠组织病理变化

选取大鼠病变区胃组织和十二指肠，10%中性甲醛固定、梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，间断连续5 μm厚切片，HE染色、脱水、透明、封片。光学显微镜下观察肺组织病理改变。

2.2.3 RT-PCR法检测胃组织AQP1、AQP3、AQP4基因的表达

取胃组织，Trizol法提取各组肺组织总RNA，超微量紫外分光光度计检测浓度后将1 μg总RNA逆转录合成cDNA，以此cDNA为模板用荧光定量PCR试剂盒进行扩增。实验操作均按相应试剂盒说明书进行。qPCR反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火延伸30 s，循环40次。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算各组AQP1、AQP3、AQP4相对表达量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表3。

表3 引物序列

2.3 统计分析

3 结果

3.1 附子理中汤对胃溃疡大鼠一般情况的影响

如图1所示：空白组大鼠精神良好，毛发有光泽，活动、进食、排便正常，体质量饮食自然增加；模型组出现竖毛、毛色缺乏光泽、弓背、蜷卧、活动减少、便溏，肛周污秽，体质量饮食下降，胃指数、脾指数下降，与空白组相比，差异显著(P<0.05)；各药物干预组均能不同程度的改善的一般情况，与模型组相比较，差异显著(P<0.01、0.05)，干预效果为雷尼替丁稍优于附子理中汤，但两组间差异无统计学意义。

3.2 附子理中汤对胃溃疡大鼠胃肠组织病理变化的影响

如图2所示：正常大鼠胃组织大体观见胃黏膜及黏膜皱襞正常，未见糜烂、出血、溃疡灶；模型组大鼠胃组织大体观可见胃窦前壁食醋注射区形成圆形或椭圆形的深大溃疡，边缘整齐，状如刀切，底部平坦，周围糜烂充血水肿；各药物组大体观可见胃黏膜光整完好与正常无异，黏膜皱襞明显，未见糜烂、出血水肿，可见溃疡灶修复。

如图3、4所示：正常大鼠显微镜下可见胃窦壁结构完整，明显可见黏膜、黏膜下层分层，黏膜腺体排列整齐，无黏膜上皮破坏、脱落、出血、无炎性细胞浸润，胞浆匀称，无空泡及核固缩；模型组显微镜下可见胃窦壁结构明显破坏，黏膜腺体消失，黏膜面表层见渗出物及坏死组织，其下为肉芽组织，并见大量炎性细胞浸润，溃疡周围腺体胞浆有空泡，核固缩或细胞破裂，而间质见充血水肿及新生毛细血管出现；各药物组显微镜下可见胃窦壁局部腺体排列紊乱，渗出物及坏死组织逐渐吸收、排出，已被破坏的肌层由底部肉芽组织增生形成瘢痕充填修复，未见明显出血及炎性细胞浸润。

如图5、6所示：正常大鼠十二指肠可见肠黏膜和黏膜下层结构完整且连续，肠绒毛排列整齐，肌层正常，无黏膜上皮破坏、脱落、出血，无炎性细胞浸润；模型组大鼠肠黏膜和黏膜下层破坏且不连续，肌层受损，黏膜面表层见渗出物及坏死组织，其下为肉芽组织，炎性细胞浸润，炎症严重；各药物组肠黏膜和黏膜下层开始修复且部分见连续，肌层由底部肉芽组织增生形成斑痕组织充填修复，炎症渗出物逐渐吸收、排出，见肠绒毛增生。

3.3 附子理中汤对胃溃疡大鼠AQP1、AQP3和AQP4基因表达的影响

如图7所示：食醋灌胃干预后，胃组织中AQP1表达水平下降,AQP3、AQP4表达水平增加，与正常对照组比较，差异显著(P<0.05)。药物干预后各组大鼠胃组织中AQP1水平不同程度增加，AQP3、AQP4水平不同程度降低，与模型组比较，差异显著(P<0.05)。干预效果为雷尼替丁优于附子理中汤。

图1 各组大鼠体质量、饮食、胃指数、脾指数的比较

图2 各组大鼠胃组织大体标本的比较

图3 各组大鼠胃组织病理变化的比较(HE，×40)

图4 各组大鼠胃组织病理变化的比较(HE，×100)

图5 各组大鼠十二指肠病理变化的比较(HE，×40)

图6 各组大鼠十二指肠病理变化的比较(HE，×100)

图7 各组大鼠胃组织中AQP1、AQP3和AQP4mRNA表达的比较

4 讨论

食醋灌胃干预后使得大鼠胃黏膜受损，使胃上皮细胞间的紧密连接处脂肪蛋白质、微循环等被破坏，胃的负担加重或刺激过强，从而形成溃疡[6]。溃疡的发生与水液代谢的动态平衡密切相关。水通道蛋白(AQPs)是近年发现的介导水液跨膜转运的一类膜蛋白[7-8]，在哺乳动物组织内广泛分布，人体的胃组织中AQP1、AQP、3AQP4表达强烈[5]。有研究表明[9-11]，AQP1和AQP4在维持胃黏膜完整性方面起着重要作用，增强了胃对乙醇所致水肿的防御,AQP3在胃腺癌细胞中起着重要作用，参与幽门螺旋杆菌感染引发胃癌的过程。胃炎、胃溃疡等胃肠道疾病的发生、发展和转归均与AQPs对水液代谢调节密切相关[12-13]。AQP1和AQP4还参与了乙醇和辣椒素致急性胃黏膜水肿和损伤的进程[2]。因此，水通道蛋白是药物治疗水液代谢平衡失调的重要作用靶点[14]。本研究结果证实AQP1、AQP3和AQP4在胃溃疡的发病机制中有着重要作用，通过介导水液跨膜转运，调节水液代谢的动态平衡，改善胃黏膜的溃疡程度，起到治疗作用，与溃疡程度成负相关。

附子理中汤为《伤寒论》理中汤加大辛大热之附子而成，是传统的温中名方。《伤寒论》中记载理中汤由附子、人参、干姜、白术和炙甘草组成；具有补虚回阳，温中祛寒，补气健脾的作用。方中附子和干姜具有抗溃疡和镇痛抗炎的作用，对温里药治疗脐腹冷痛起到了加强作用；甘草、白术也都具有抗消化道溃疡、抗炎镇痛的药理作用；且甘草解百毒，与附子、干姜同煮，可使附子毒性大减。诸药合用，标本兼顾，脾肾双补，温中散寒，中阳建运，复使清阳上升，浊阴下降，清浊各行其道，故临床疗效显著。现代药理实验研究证明[15]，附子理中汤能增强小鼠的耐寒能力，对醋酸引起的小鼠腹痛有显著的镇痛作用，同时还可显著提高胃黏膜的SOD活性，降低MDA的含量，发挥其对胃黏膜保护作用，从而加速溃疡愈合。

综上所述，附子理中汤能显著提高AQP1的表达,下调AQP3和AQP4的表达，表明附子理中汤抗食醋诱导的大鼠胃溃疡的药效机制可能是通过提高AQP1和下调AQP3、AQP4的表达，调节水液代谢动态平衡，介导水液跨膜转运，进而起到保护胃黏膜的作用，最终改善大鼠胃组织溃疡和水肿程度。但水液代谢平衡与AQP1、AQP3和AQP4是否为食醋诱导大鼠胃溃疡的唯一机制还需进一步的机制研究，而附子理中汤的药效成分复杂，作用靶点多样，其抗食醋诱导的大鼠胃溃疡的物质基础需要进一步研究。