一氧化氮对弱光胁迫下苗期及坐果初期辣椒生长和抗性相关指标的影响

李 莉，田士林，*，姜 俊，宋 丽

(1.黄淮学院 生物与食品工程学院，河南 驻马店 463000； 2.驻马店市农业科学院 园艺研究所，河南 驻马店 463000)

在植物生长过程中，逆境胁迫是植物生长经常要面临的问题，轻微的胁迫植物可以通过自身的调控来缓解逆境带来的不利影响，通常植物通过启动抗氧化酶(SOD、POD、CAT)来抵御和清除活性氧，维持膜的稳定性[1]；当逆境胁迫超出植物自我调节能力时，植物体活性氧代谢失调从而导致自由基积累，并进一步导致细胞膜结构损伤[1]。

光照不足是近年来设施园艺中常见的逆境胁迫。在弱光条件下，植物光合作用降低，叶绿素含量出现异常，这一现象常常与谷氨酰-tRNA还原酶基因(HEMA1)、叶绿素酸酯a氧化酶基因(CAO)、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸基因(GGPP2)的失调密不可分[2]。GGPS2、CAO和HEMA1基因是调控植物进行光合作用的关键基因，GGPS基因表达水平的高低不仅会影响植物光合器官中类胡萝卜素的合成，而且会影响类异戊二烯途径中叶绿素等物质的合成[2]；CAO基因是催化脱植基叶绿素a形成叶绿素b的唯一基因，在弱光胁迫下通过调控叶绿素b含量使植物更好地适应弱光环境[3]；HEMA1基因是代谢和环境调控的关键酶基因，该基因受光诱导，在光合组织中表达[3]。弱光环境下，上述3个基因的变化可以反映植物对弱光环境的适应能力[2-3]，基因表达的变化会导致叶绿素的合成受阻，最终影响蔬菜的产量和品质[4]。

近年来，随着温室大棚的广泛应用，蔬菜瓜果实现了周年供应。受价格规律的影响，反季节蔬菜生产呈逐年上升的趋势，然而，光照不足在大棚生产中最为常见[5]。辣椒属于中光性植物，光照不足容易引起品质降低[5]。因此，寻找一个简单、快速、经济的栽培措施，用于缓解弱光对辣椒苗期生长所造成的不利影响至为重要。一氧化氮(nitric oxide，NO)既是一个气态自由基也是一个多功能细胞信号传导效应器，在不同的生理过程中扮演着重要的作用[6]。研究表明，NO参与调控植物的抗病、气孔关闭、非生物逆境胁迫、铁离子平衡以及生长发育等方面[7]。硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)是外源NO的直接供体，利用SNP作为NO的发生器在植物逆境调控方面已经得到广泛应用[8-9]。有研究表明，适当浓度的SNP能有效缓解逆境对多种植物生长造成的伤害[8-12]。付娟娟等[13]选用冷季型草坪草高羊茅为材料，通过研究不同遮阴强度和不同遮阴时间对高羊茅的膜透性及抗氧化酶活性的影响，结果表明，外源NO可以显著提高遮阴胁迫下高羊茅叶片的叶绿素含量，降低质膜相对透性的增加，减少膜质过氧化产物MDA含量的升高，促进脯氨酸的积累，提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性。外源NO能否减轻弱光环境对辣椒植株造成的伤害尚未见相关报道。本研究拟设置不同程度的遮阴处理(轻度遮阴LS、中度遮阴MS、重度遮阴SS)模拟弱光环境条件，采用SNP作为NO的供体，探讨外源NO对遮阴辣椒苗期抗氧化系统的影响，为辣椒耐弱光遗传资源的筛选及设施栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为光强敏型辣椒材料WM-1，为早熟品种，果实朝天簇生，株高30～40 cm，果实初期乳白，成熟后浅红，微辣。每簇结5～6个果，果长4～5 cm，果径1 cm左右，单果质量3～4 g，坐果力强。种子由河南省辣椒核心种质资源创制及分子育种创新团队提供。

1.2 方法

1.2.1 试验布置

试验于黄淮学院智能温室内进行。当辣椒长出3～4片真叶时，移栽于花盆(20 cm×14 cm)，盆土成分为泥炭、沙子和珍珠岩(体积比1∶1∶1)，每盆1株，按照随机区组设计布置。2周后，选出70株相同苗龄、相同高度、相同茎粗、相同叶片数、相同健康程度的辣椒苗为试材。其中，对照(CK)10株、轻度遮阴(LS)20株、中度遮阴(MS)20株、重度遮阴(SS)20株。每3 d浇一次霍格兰营养液，每盆每次浇200 mL。

1.2.2 遮阴处理

智能温室内采用黑色透气遮阳网进行遮阴，设置对照(CK)和3种遮阴处理(轻度遮阴、中度遮阴、重度遮阴)。对照(CK)光强，1 000 μmol·m-2·s-1；轻度遮阴(LS)光强，600 μmol·m-2·s-1；中度遮阴(MS)光强，300 μmol·m-2·s-1；重度遮阴(SS)光强，100 μmol·m-2·s-1。生长温度：白天28 ℃/夜晚20 ℃，光照时间：白天10 h/夜晚14 h。

1.2.3 SNP配制及喷施

2000年11月，美国国会在水资源发展法中通过了大沼泽地综合修复计划。这是美国有史以来最大的环境修复工程，共有60个单项，计划30年完成。该计划的主要目标：一是增加自然生态的空间面积，改善栖息环境及其相应功能，增加原生态动植物种群的数量和多样性；二是增加区内工农业及城镇供水量，降低洪水灾害。修复计划有四项主要措施：

SNP购自Sigma公司，使用前30 min用蒸馏水配成0.1 mmol·L-1SNP工作液[9]，置于4 ℃冰箱保存备用。每天下午18:00进行喷施，用SNP溶液分别对轻度遮阴、中度遮阴、重度遮阴辣椒植株进行均匀喷施，每隔30 min喷施一次，连续喷施3次，分别对3组喷施过SNP溶液的遮阴植株进行挂牌，标记为LS+SNP(轻度遮阴+SNP)、MS+SNP(中度遮阴+SNP)、SS+SNP(重度遮阴+SNP)。

1.2.4 样品采集

从SNP喷施后的第5天开始，分别采集不同处理组辣椒叶片，带回实验室进行相关指标测定。每5 d进行一次采样，至第15天采样结束。

1.2.5 相关指标测定

SOD、POD、CAT活性的测定分别采用氮蓝四唑(NBT)法、分光光度法和紫外吸收法[3]；叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量的测定采用叶绿素含量测定仪(SPAD502)；叶面积的测定采用数格子法：沿着叶子的形状将其画下来，画在透明的坐标纸上，然后数格子。计算格子时，叶片边缘凡超过半格的计算为1，不足半格则不计数，根据数出的格子数就是叶片的面积数。以上所有指标均重复测定3次，其结果以平均值±标准误表示。

1.2.6 半定量RT-PCR

采用Trizol法提取辣椒叶片总RNA，用微量紫外分光光度计(ND-1000，美国)测定纯度及定量(D260/D280、D260/D230)，-80 ℃保存。采用cDNA一链合成试剂盒(上海生工)，对纯化后的RNA进行反转录，合成cDNA一链，-20 ℃保存备用。按照半定量RT-PCR的要求，重复3次。根据辣椒基因组中GGPS2、CAO和HEMA1基因相对应的CDS序列和Ubi3基因序列，设计半定量RT-PCR引物(表1)。

表1 引物序列

Table1Primer sequences used for qPCR

基因Gene 序列号Accession number引物名称Primer name引物序列Sequence(5′→3′)GGPS2Capana04g000412GGPS2-FGGPS2-RTTGAAGCAGCACAGACGGCGAGAAGGGAATAACGCAOCapana00g004119CAO-FCAO-RGCCACGAGACAAGGAACAGAGTCGGGGATTGATAGTHEMA1Capana04g000804HEMA1-FHEMA1-RAGTTCTGGTGGAAATGTGACTGGATACTAAGCCCAATGACUbi3AY486137.1Ubi3-FUbi3-RGTTGTCTCTCGTCTACCTTGTCAGAATAACACGAACCCCAC

Ubi3用作内参基因，F为正向引物，R为反向引物。

Ubi3 was used as internal control (reference gene); F， Forward primer; R， Reverse primer.

以PCR扩增出的条带清晰可见为原则对模板浓度进行调整，将反转录得到的cDNA一链适当稀释至50 ng·mL-1，作为半定量RT-PCR模板。PCR扩增体系为15 μL：上游引物和下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL，5×Buffer(含Mg2+)1.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)0.3 μL，Taq酶0.12 μL，模板cDNA 1.5 μL，ddH2O至10.58 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，温度分别为48 ℃(HEMA1、CAO的引物)、47℃(GGPS2、Ubi3的引物)，72 ℃延伸1 min，26～28个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃终止反应。取10 μL PCR产物分别点样至1%琼脂糖凝胶样品孔中，在1×TAE电泳缓冲液中检测PCR产物，全自动凝胶成像分析仪(上海培清JS-680C)照相分析电泳结果。

采用SAS (SAS Institute， version 8.2)对数据进行处理，采用SigmaPlot10.0软件进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 SNP对弱光胁迫下辣椒植株生长状况的影响

由表2可以看出，随着遮阴加重，辣椒结果能力减弱、分枝降低、叶片稀而少；经SNP处理后，植株的株高、茎粗、叶面积比遮阴植株显著增加；在轻度遮阴条件下，SNP可以提高果实的质量。值得提出的是：经SNP处理过的中度遮阴(MS)和重度遮阴(SS)植株，植株的分枝数明显增加。

表2SNP对遮阴处理下辣椒生长指标的影响

Table2Effect of SNP on pepper growth indicators under weak light stress

材料Material株高Plant height/cm茎粗Stem diameter/cm叶面积Leaf area/cm2分枝数Number of branches 果实质量Fruit weight/gCKLSLS+SNPMSMS+SNPSSSS+SNP38.53 b38.48 c38.87 a33.21 f33.72 d31.14 g33.42 e0.75 a0.72 b0.75 a0.58 d0.62 c0.46 e0.59 d35.73 a35.65 b35.72 a27.81 e29.81 c23.67 f28.12 d5 a5 a5 a2 c3 b1 d3 b3.22 a2.31 c3.20 b————

CK，对照株，正常光照；LS，轻度遮阴；MS，中度遮阴；SS，重度遮阴；LS+SNP，对轻度遮阴植株采用SNP处理；MS+SNP，对中度遮阴植株采用SNP处理；SS+SNP，对重度遮阴植株采用SNP处理。同列数据后无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。 “—”为未检测到。

CK， The control (unshaded plants); LS， Light shaded treatment; MS， Moderate shaded treatment; SS， Severe shaded treatment; LS+SNP， SNP treatment on the light shaded plants; MS+SNP， SNP treatment on the moderate shaded plants; SS+SNP， SNP treatment on the severe shaded plants. Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05. "—"， undetected.

2.2 SNP对不同弱光胁迫下辣椒幼苗SOD、POD和CAT活性的影响

从图1-A中可以看出，处理第5、10、15天时，正常光照植株的SOD活性未发生明显变化；不同程度遮阴处理后，辣椒植株SOD活性增加；与单独遮阴处理相比，SNP处理后，遮阴植株叶片中的SOD活性普遍增加。说明SNP的施用提高了遮阴环境下辣椒植株的SOD活性，提高了弱光环境条件下辣椒的抗氧化能力。

从图1-B中可以看出，遮阴处理后，取样检测结果表明，第5天、第10天、第15天对于正常光照植株来说，POD活性未发生明显的变化；不同程度遮阴处理的辣椒植株POD活性增加；与单纯遮阴辣椒植株相比，采用SNP处理遮阴的辣椒植株，叶片的POD活性普遍增加。因此，SNP的施用提高了辣椒植株中POD活性，增强了弱光环境条件下辣椒的抗逆性。

从图1-C中可以看出，遮阴处理后，取样检测结果表明，第5天，轻度遮阴未发生明显变化，中度遮阴和重度遮阴经SNP处理后效果明显；第10天，无论是轻度遮阴、中度遮阴还是重度遮阴经SNP处理后CAT活性明显增加；第15天，除重度遮阴胁迫经SNP处理后有轻微提高外，SNP处理15天时对遮阴植株CAT活性的提高已经没有影响，说明SNP处理有一定的时间效应。因此，SNP的喷施提高了辣椒CAT活性，一定时期内提高了弱光环境条件下辣椒的抗逆性。

图1 SNP对不同弱光胁迫下辣椒幼苗SOD、POD和CAT活性的影响Fig.1 Effect of SNP on SOD， POD and CAT activity of pepper seedlings under different weak light stress

2.3 SNP对不同弱光胁迫下辣椒幼苗叶片叶绿素含量的影响

从图2-A可以看出：第5天、第10天、第15天，相对于未喷施SNP辣椒植株来说，喷施SNP后辣椒叶片中的叶绿素a的SPAD值均表现为不同程度的提高，其中第15天SNP处理过的轻度遮阴植株叶绿素a的SPAD值与轻度遮阴植株差异显著。因此，SNP的施用可以增强弱光胁迫下辣椒植株的抗逆能力。

从图2-B可以看出：第5天、第10天，喷施SNP后辣椒叶片中的叶绿素b的SPAD值与未喷施SNP的遮阴植株相比均表现为不同程度的提高；喷施SNP后的第15天，辣椒叶片中的叶绿素b的SPAD值差异不显著。

由图2-C得知，第5天，SNP处理过的轻度遮阴和中度遮阴植株叶片中的叶绿素a+b的SPAD值略有提高，SNP处理过的重度遮阴植株叶片中的叶绿素a+b的SPAD值有不同程度的降低；第10天，SNP处理过的轻度遮阴和中度遮阴植株叶片中的叶绿素a+b的SPAD值略有提高，SNP处理过的重度遮阴植株叶片中的叶绿素a+b的SPAD值无显著差异；第15天，SNP处理过的轻度遮阴、中度遮阴和重度遮阴植株叶片中的叶绿素a+b的SPAD值均有提高，但只有SNP处理过的轻度遮阴和中度遮阴叶绿素a+b值差异显著；SNP提高了轻度遮阴和重度遮阴辣椒叶片中叶绿素a+b的SPAD值，对重度遮阴效果不明显。

图2 SNP对不同弱光胁迫下的辣椒幼苗叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of SNP on chlorophyll content in pepper leaves under different weak light stress

2.4 SNP对叶绿素合成相关基因表达水平的影响

取不同处理的辣椒叶片1 μL总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳后，28S RNA和18S RNA条带清晰，完整性较好，无明显降解(图3-A)。紫外分光光度计测得所提RNA的D260/D280值约为2.0，表明总RNA提取质量较好，符合进一步RT-PCR的要求；确定适宜的循环次数是保证实验结果准确性的关键因素之一，本试验以Ubi3为内参基因[14]，在25～30个循环数内来探索内参基因和叶绿素酶基因的指数期，根据PCR电泳扩增结果(图3-B)，确定了内参Ubi3基因在28个循环时达到指数期，参试的3个叶绿素酶基因HEMA1、CAO、GGPS2对应的指数期分别为26、28和27个循环，分别以上述循环数进行RT-PCR扩增；从图3-C中可以看出，弱光胁迫后，与对照(CK)相比，植株叶片中的GGPS2基因、CAO基因和HEMA1基因表达水平增强，而喷施过SNP的辣椒植株3个基因的表达水平更强。由此可知，SNP处理促进了GGPS2基因、CAO基因和HEMA1基因的表达，增强了辣椒的耐弱光性。

3 讨论

低温弱光等环境因子是反季节设施蔬菜生产主要因素。在逆境胁迫下，植物形态特征变化可以直接反映植物的受伤害状况，是评价植物抗逆性强弱的最直接指标[4]。本研究中，遮阴导致辣椒植株叶片少、分枝差、植株生长势弱；采用SNP处理后，处理组植株(MS+SNP和SS+SNP)长势明显好于遮阴组植株(MS和SS)。因此，对于反季节大棚辣椒，可以通过喷施SNP来缓解弱光对辣椒植株生长的影响。

A，RNA质量；B，RT-PCR最佳循环数；C，相关基因表达水平。A， The quality of RNA; B， The optimal number of cycles for RT-PCR; C， The level of expression of related genes.图3 HEMA1、CAO和GGPS2的表达水平的变化Fig.3 Changes in the expression levels of genes HEMA1， CAO and GGPS2

总之，在遮阴情况下，SNP能够提高辣椒植株SOD、POD、CAT活性，增强了植株的耐弱光性；叶绿素a含量和叶绿素b含量的增加，提高了弱光环境下辣椒光合能力；同时，SNP处理也在一定程度上提高了叶绿素合成相关基因的表达水平。这些结论表明：NO有利于弱光环境下辣椒抗性的提高和光合能力的恢复，对于弱光环境下辣椒的生产提供参考。