LED光质对钝顶螺旋藻抗氧化成分的影响

兰蓉 沈荣 王佔刚

摘要：为探究光质对螺旋藻抗氧化成分和活性的影响规律，以发光二极管（LED）为光源，以白光为对照，在5种单色光和5种红蓝组合光下培养螺旋藻，测定其次生代谢类抗氧化成分含量、抗氧化酶活性和总抗氧化能力。结果表明：蓝光显著提高螺旋藻维生素C含量、黄酮含量、抗氧化酶活性和总抗氧化能力;黄光组的维生素C含量、黄酮含量、总抗氧化能力最低;绿光和蓝光显著提高维生素E含量;红光组的维生素E含量、抗氧化酶活性最低;蓝光比例为20%的红蓝组合光处理后，螺旋藻维生素C和黄酮含量达到最高值;蓝光比例为30%的红蓝组合光处理后，维生素E含量、抗氧化酶活性和总抗氧化能力达到最高值。因此，蓝光和红蓝组合光是螺旋藻合成抗氧化成分的高效光质，蓝光比例为20%～30%的红蓝组合光最利于螺旋藻抗氧化成分的合成和积累。

关键词：发光二极管;光质;螺旋藻;抗氧化

中图分类号： S968.4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0184-04

螺旋藻又称蓝细菌（cyanlbacteria），是地球上最古老的光合生物之一。国内外大量研究表明[1-3]，螺旋藻营养全面且富含多种抗氧化活性成分，是一种安全可靠的天然抗氧剂，可以提高机体的抗氧化能力，对抗活性氧及自由基引发的脂质过氧化及相关疾病。因此，提高螺旋藻中抗氧化活性成分含量从而进一步改善其营养品质具有重要意义。

发光二极管（LED）灯具有体积小、节能、寿命长、波长可控和热辐射低等优势，目前已经成为受控环境中植物生长所用的首选光源[4-5]。一些植物方面的研究表明，通过优化光质条件可以提高植物中抗氧化活性成分的含量。增加蓝色LED光质比例可促进樱桃番茄果实中番茄红素和类黄酮的形成[6]。红光能够明显地增加豌豆苗β-胡萝卜素的含量以及对健康有益的营养成分的抗氧化活性[7]。目前，关于光质对螺旋藻生长和形态影响的研究较多[8-11]，而对抗氧化活性成分积累的研究鲜有报道。本研究采用不同的LED光源，设置5种单色光和5种红蓝组合光对钝顶螺旋藻进行培养，探究不同光质对螺旋藻抗氧化成分和活性的影响规律，筛选螺旋藻高效培养光质条件，为定向培育螺旋藻的光环境调控技术和改善螺旋藻营养品质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

钝顶螺旋藻（Spirulina platensis），由中国科学院水生生物研究所藻类生物学重点实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 螺旋藻的培养

钝顶螺旋藻按照3.5%（体积分数）的接种量接种在装有适量Z氏培养液[12]的气升式光反应器中。光源为深圳方洲照明有限公司的LED灯珠，反应器中心的光合有效辐射强度（PAR）为3.90 mW/cm2。反应器的培养温度为25 ℃，CO2浓度为500 mg/L，通气量为0.6 L/min，光周期为23 h/d，培养周期为7 d，重复3次[13]。试验设10种光质处理：白光（全光谱，W）、红光（620～630 nm，R）、黄光（580～590 nm，Y）、蓝光（460～470 nm，B）、绿光（520～530 nm，G）、红光 ∶蓝光=9 ∶1（9R1B，红光比例90%）、红光 ∶蓝光=8 ∶2（8R2B，红光比例80%）、紅光 ∶蓝光=7 ∶3（7R3B，红光比例70%）、红光 ∶蓝光=6 ∶4（6R4B，红光比例60%）、红光 ∶蓝 光=5 ∶5（5R5B，红光比例50%），以白光作为对照。

1.2.2 螺旋藻样品的前处理

培养结束后，收集螺旋藻藻液，用400目滤网过滤，-20 ℃冷冻，用冷冻干燥机完全冻干后研磨，过40目筛，备用。

1.2.3 维生素C含量的测定

1.2.3.1 维生素C标准曲线的制备 称取25 mg维生素C，用1% HCl定容到100 mL，量取上述溶液10 mL，用1% HCl定容到100 mL，得到25 μg/mL维生素C标准溶液。分别量取上述溶液2、4、6、8、10 mL，用蒸馏水定容到25 mL，在波长243 nm处测定D值。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标制作标准曲线。结果标准方程为ρ=16.626D-0.032，r2=0.999 4。

1.2.3.2 样品维生素C的测定 称取固体样品50 mg，加1% HCl溶解定容到10 mL，超声15 min，过滤，取过滤液2 mL加1% HCl 2 mL，用蒸馏水定容到25 mL，在波长243 nm处测定D值。

1.2.4 总黄酮含量的测定

1.2.4.1 黄酮标准曲线的制备 称取芸香苷10 mg，用60%乙醇完全溶解，在50 mL容量瓶中定容到刻度线，得到 0.2 mg/mL 芸香苷对照品溶液。精密吸取芸香苷对照品0、1、2、3、4、5 mL分别置于25 mL容量瓶中，补加蒸馏水使所有容量瓶内溶液在相同高度，加1 mL 5% NaNO2，室温放置 6 min;加1 mL 10% Al（NO3）3，室温放置6 min，加1 mol/L NaOH 10 mL，用60%乙醇定容至25 mL，摇匀放置15 min，在波长 505 nm 处测定各溶液的D值，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标制作标准曲线。结果标准方程为ρ=0.086 9D-0.000 6，r2=0.999 9。

1.2.4.2 样品总黄酮的测定 称取固体样品100 mg，加入 1 ∶25 的HCl-乙醇（1% HCl、70%乙醇）定容到10 mL，超声15 min，取上清液2 mL，加1 mL 5% NaNO2，室温放置6 min;加1 mL 10% Al（NO3）3，室温放置6 min，加1 mol/L NaOH 10 mL，用60%乙醇定容至25 mL，在波长505 nm处测定D值。

1.2.5 抗氧化酶活性、维生素E含量和总抗氧化能力的测定

1.2.5.1 过氧化物酶（POD，EC 1.11.1-X）活性的测定 冻干样品10 mg溶于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值=7.2）中，冰水浴条件下超声15 min，制成5%的匀浆液，4 ℃、4 000 r/min 离心10 min，上清液进行POD活性测定。

1.2.5.2 超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）活性的测定 参照“1.2.5.1”节的方法，制成2.5%的匀浆液后离心 10 min，上清液进行SOD活性测定。

1.2.5.3 维生素E含量的测定 参照“1.2.5.1”节的方法，制成1%的匀浆液后离心10 min，上清液进行维生素E含量测定。

1.2.5.4 总抗氧化能力（T-AOC）的测定 参照“1.2.5.1”节的方法，制成10%的匀浆液后离心10 min，上清液进行 T-AOC 测定。

POD活性、SOD活性、维生素E含量和T-AOC的测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒，具体测定方法参照试剂盒说明书进行。

1.2.6 统计分析

数据采用SPSS软件的方差分析（AVONA）程序进行方差分析，并对不同处理的平均值进行多重比较（Duncan's，α=0.05），以P<0.05和P<0.01作为统计学显著和极显著意义。

2 结果与分析

2.1 不同光质对螺旋藻次生代谢类抗氧化剂含量的影响

光质条件对螺旋藻次生代谢类抗氧化剂维生素C、维生素E和总黄酮的含量有显著影响（表1）。

由表2可知，单色光处理后，黄光组、红光组和绿光组的维生素C含量与总黄酮含量均低于白光组（对照组），其中黄光组的维生素C含量和总黄酮含量最低，分别比对照组降低33.63%和18.83%;蓝光显著提高螺旋藻维生素C含量和总黄酮含量，分别比对照组提高6.19%和14.60%。与对照相比，绿光和蓝光显著提高维生素E的含量，分别提高 17.96% 和15.82%;黄光组与对照组的维生素E含量差异不显著;红光组的维生素E含量显著低于对照组。

红蓝组合光处理后，随着组合光中蓝光比例的增加，螺旋藻维生素C、维生素E和总黄酮的含量呈现出先升后降的变化趋势。8R2B组的维生素C含量达到最高值，比对照组增加10.73%;7R3B组的维生素C含量与对照组差异不显著，6R4B组、5R5B组的维生素C含量均显著低于对照组;红蓝组合光中，各处理组的维生素E含量均显著高于对照组，其中7R3B组的维生素E含量最高，其次是8R2B组，分别比对照组提高27.39%和22.86%;8R2B、7R3B和6R4B这3组的总黄酮含量均显著高于对照组，其中8R2B组最高，比对照组提高66.49%，其次是7R3B组和6R4B组，分别提高38.74%和36.59%，9R1B组和5R5B组的总黄酮含量与对照组差异不显著。

可见，蓝光有利于维生素C、维生素E和总黄酮等次生代谢抗氧化物质的合成，红光、黄光则分别抑制螺旋藻维生素E、维生素C和总黄酮积累;红蓝组合光总体上比单色光更有利于促進螺旋藻次生代谢类抗氧化剂的积累;蓝光比例为20%～30%的红蓝组合光最有益于螺旋藻次生代谢类抗氧化剂的生成。

2.2 不同光质对螺旋藻抗氧化酶活性的影响

光质条件对螺旋藻SOD和POD活性有显著影响（表1）。由图1可看出，单色光中，黄光、蓝光和绿光3组的SOD活性（图1-A）与POD活性（图1-B）均显著高于对照组，其中蓝光组的SOD和POD活性均最高，分别是对照组的2.20倍和3.34倍;红光组的SOD和POD活性均与对照组差异不显著。红蓝组合光中，各试验组SOD和POD活性随光质变化的趋势较一致，活性从高到低依次均为7R3B>8R2B>6R4B>9R1B>5R5B，其中9R1B、8R2B、7R3B和6R4B这4组的SOD与POD活性均显著高于对照组，5R5B组的SOD活性与对照组差异不显著，但其POD活性显著高于对照组;随着组合光中蓝光比例的增加，螺旋藻SOD活性和POD活性均呈现出先升后降的变化趋势;蓝光比例为30%时，SOD和POD活性达到最高值，分别是对照组的2.26、3.41倍，但与蓝光组无显著差异。可见，蓝光组和红蓝组合光比其他处理组更有利于螺旋藻抗氧化酶活性的提高。

2.3 不同光质对螺旋藻总抗氧化能力的影响

光质条件对螺旋藻总抗氧化能力（T-AOC）有显著影响（表1），但不同光质对螺旋藻总抗氧化能力的影响不同（图2）。由图2可看出，在单色光中，蓝光组与红光组的总抗氧化能力显著高于对照组，分别比对照组增加33.83%和 17.05%;黄光组与绿光组的总抗氧化能力显著低于对照组，分别比对照组降低50.02%和33.03%。在红蓝组合光中，随着蓝光比例的增加，螺旋藻总抗氧化能力呈现出先升后降的变化趋势，从高到低依次为7R3B>8R2B>6R4B>9R1B>5R5B，其中8R2B、7R3B和6R4B这3组的总抗氧化能力均显著高于对照组，分别比对照组增加了42.82%、46.28%和 29.29%，蓝光比例为30%的7R3B组总抗氧化能力最高;9R1B组和5R5B组的总抗氧化能力与对照组差异不显著。可见，红蓝组合光总体上更有利于螺旋藻总抗氧化能力的提高。

2.4 螺旋藻抗氧化成分含量与总抗氧化能力的相关性分析

由表3可知，螺旋藻中维生素C含量、总黄酮含量与其总抗氧化能力呈显著正相关，而维生素E含量、SOD活性和POD活性与其总抗氧化能力间无显著相关性。结果表明，螺旋藻维生素C和总黄酮含量的增加有利于提高螺旋藻的总抗氧化能力。

3 讨论与结论

光质是螺旋藻人工培养过程中一个重要的环境因素，它不仅能够影响螺旋藻的生长、藻丝体的形态建成和色素组成，还能够调节螺旋藻次生代谢产物的合成。本研究表明，不同光质处理对螺旋藻中维生素C、维生素E和总黄酮等次生代谢抗氧化物质的合成和积累有显著影响。单色光中，蓝光有利于维生素C、维生素E和总黄酮等次生代谢抗氧化物质的合成，而黄光处理的螺旋藻维生素C和总黄酮含量最低，这与前人的研究结果相符[13-15]。蓝光可提高维生素C合成途径中关键酶——半乳糖酸内酯脱氢酶的活性[16]，还可刺激一些影响黄酮类化合物合成的主要酶——苯丙氨酸裂解酶（PAL）等的活性或上调其相关基因的表达[17]，这些可能是蓝光增加维生素C、维生素E和总黄酮含量的原因。红蓝组合光中，蓝光比例为20%时，螺旋藻维生素C和总黄酮含量最高，蓝光比例为30%时，螺旋藻维生素E含量最高，三者均高于单色光最高值，说明红蓝组合光较单色光更有利于次生代谢抗氧化物质的合成和积累，可能是各单色光间具有互补和加性效应[18]。刘建福等的研究也表明，红蓝组合光有益于次生代谢产物的积累[19]。

SOD和POD是生物体抗氧化酶体系的关键组成部分，能清除生物体在逆境中产生的氧自由基，形成一定程度的保护作用，从而延缓生物体的衰老与死亡。周琳等发现白光、蓝光处理后的茶树愈伤组织抗氧化酶活性较高，而红光处理后的活性则显著低于其他处理组[20]。王虹等的研究表明，蓝光可诱导黄瓜抗氧化酶基因的表达和酶活的上升[21]。还有研究表明，蓝光处理后的茅苍术抗氧化酶活性显著高于红蓝组合光组[22]。原因可能是蓝光具有较高的能量，易造成蓝光损伤[23-24]，细胞需要合成更多的抗氧化剂来降低氧化胁迫。本研究结果与上述报道基本相符，但蓝光组与红蓝组合7R3B组的SOD与POD活性水平无显著差异。另外，本试验中SOD和POD活性随光质变化的趋势较一致，这是因为生物体抗氧化酶体系是协同作用防止活性氧的损伤效应，SOD将超氧阴离子转变为H2O2，POD则把SOD等产生的H2O2变成H2O，使活性氧维持在较低水平上。

总抗氧化能力与次生代谢产物是否具有相关性，目前的研究结果不尽相同。任锦等的研究认为紫背天葵叶片黄酮含量与其抗氧化活性之间存在较高的相关性[25]。但李亚华等的研究发现茄子果肉黄酮含量与其总抗氧化能力间无显著相关性，而维生素C含量与其总抗氧化能力呈显著正相关[26]。本研究中，螺旋藻总黄酮和维生素C含量与其总抗氧化能力均呈显著正相关，表明本试验条件下螺旋藻的总抗氧化能力主要是由黄酮和维生素C决定的。

综上所述，蓝光显著提高螺旋藻维生素C含量、总黄酮含量、抗氧化酶活性和总抗氧化能力，绿光和蓝光显著提高维生素E含量，而黄光抑制维生素C和黄酮的生成，红光抑制维生素E的合成并降低抗氧化酶活性;红蓝组合光中蓝光比例为20%时，螺旋藻维生素C和总黄酮含量达到最高值;蓝光比例为30%时，维生素E含量、抗氧化酶活性和总抗氧化能力达到最高值。因此，红蓝组合光和蓝光是螺旋藻合成抗氧化成分的高效光质，蓝光比例为20%～30%的红蓝组合光最利于螺旋藻抗氧化成分的合成和积累。本研究只考虑了光质对螺旋藻抗氧化成分的影响，今后应结合螺旋藻生长阶段、光照强度和光照时间等因素开展进一步研究，為螺旋藻的优质高效培养奠定良好基础。

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