苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Ｂｔｉ）发酵液的浓缩工艺研究

陈伟　廖先清　刘芳　饶犇　周荣华

摘要：通过对苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，Bti）发酵液浓缩工艺的研究，探索了不同温度对浓缩液有效成分的影响程度，比较了不同浓缩方式、不同干燥方式处理下有效成分的回收率。结果表明，采用真空薄膜浓缩方式最终得到的产物质量是离心浓缩方式得到产物质量的176%，效价回收率提高了36%。

关键词：苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis）;真空薄膜浓缩;离心浓缩

中图分类号：Q813.1         文獻标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）22-0111-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.025           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Studies on concentration process of BTi fermentation broth

CHEN Wei，LIAO Xian-qing，LIU Fang，RAO Ben，ZHOU Rong-hua

（Hubei of Biopesticide Engineering Research Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： Through the study on the concentration process of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis（Bti） fermentation broth， the effects of different temperatures on the active components of the concentrate were explored. The recovery rates of the active components under different concentration methods and different drying methods were compared. The results show that the quality of the product finally obtained by the vacuum film concentration method is 176% of the mass of the product obtained by centrifugal concentration， and the recovery rate of the potency is increased by 36%.

Key words： Bacillus thuringiensis subsp. israelensis; vacuum film concentration; centrifugal concentration

苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，简称Bti）是Goldberg和Margalit于1977年发现的一种对蚊科幼龄害虫具有高度毒力的病原细菌。自发现以来，人们利用Bti制剂为控制蚊媒病的传播进行了大量工作。

目前Bti常规的生产方法是采用相关的芽孢杆菌生产菌种，分批发酵培养，至其大部分或者全部形成芽孢时，采用板框过滤或者离心的方式进行浓缩，添加助剂后烘干或者喷雾干燥得到芽孢杆菌的活菌制剂[1-5]。这些方法存在着严重的不足，发酵液的浓缩采用的絮凝/板框过滤或者离心技术一般都会产生大量的废水，后续处理成本较高;采用絮凝/板框过滤或者离心技术还会造成发酵液上清里的有效成分丢失，产品质量下降。而且传统的絮凝/板框过滤或者离心浓缩方法会产生大量生化需氧量（BOD）很高的废水，需要进行复杂的处理才可能达到排放标准。因此，有必要对芽孢杆菌发酵液后处理的工艺进行研究，以达到提高后处理过程中芽孢及其所产生的活性物质的收率，减少后处理工艺所产生的废水泊BOD[6-12]。而采用真空薄膜浓缩后，优点在于直接浓缩发酵液，相比于传统的絮凝/板框过滤或者离心浓缩方式，发酵液中可溶性的增效物质、促生物质、抑菌活性物质等得到有效回收。低温浓缩过程中产生的冷凝水，生化需氧量极低，一般在80以下，达到排放标准。

本研究在前期其他芽孢杆菌浓缩工艺研究的基础上，详尽研究了苏云金芽孢杆菌以色列亚种NBIM-301的浓缩工艺，主要是浓缩条件和回收率的研究。

1  材料与方法

1.1  材料

菌种：苏云金芽孢杆菌以色列亚种NBIM-301系湖北省生物农药工程研究中心分离并保存;发酵液由湖北省生物农药工程研究中心工程技术研究室提供。

仪器：真空薄膜浓缩器（蒸发量30 L/h）、LGJ-200F型冷冻干燥机、喷雾干燥塔（蒸发量10 L/h），黑龙江大三源乳品机械有限公司;Eppendorf 5424型离心机，艾本德中国有限公司。

1.2  方法

1.2.1  真空薄膜浓缩  取5 L发酵液加入真空薄膜浓缩器进料容器中，经加热器加热到设定温度后送至分离器，在真空度-90～-80 kPa下进行蒸发和分离，蒸气通过冷凝器冷凝成水后排出，浓缩后的物料取出后通过不同方式进行干燥。

1.2.2  离心浓缩  取5 L发酵液加入管式离心机，在18 000 r/min转速下进行离心分离，倒掉上清液，取出沉淀通过不同方式进行干燥。

1.2.3  冷冻干燥  将浓缩物放入冷冻干燥机中24 h，待完全干燥后取出，称重后备用。

1.2.4  喷雾干燥  将浓缩物在进口风温150 ℃、塔内温度60 ℃条件下进行喷雾干燥，收集称重后备用。

1.2.5  分析检测  以色列亚种NBIM-301采用GB/T19567.1-2004中生物测定法测定生物效价。

1.2.6  总有效成分计算方法  总有效成分=生物效价×质量。

1.2.7  有效成分回收率计算  有效成分回收率=不同处理的产物质量×产物生物效价×100/发酵液直接冻干的产物总有效成分。

1.2.8  工艺废水化学需氧量和5 d生化需氧量检测  取离心浓缩上清液和真空薄膜浓缩冷凝液各5 L送武汉市环境监测中心委托检测，采用GB11914-1989、HJ505-2009两项标准中的方法进行。

2  结果与分析

2.1  最适浓缩温度

NBIM-301的结果表明，50 ℃和60 ℃处理后，效价差异在10%以内但60 ℃温度更高，浓缩所需的时间更少，分离效率要高于50 ℃。70 ℃处理时产品效价很低（表1）。

进一步研究了55、60、65 ℃条件下的浓缩试验，结果表明，虽然65 ℃效价比60 ℃时要低，但65 ℃温度更高，浓缩所需的时间更少，浓缩效率高（表2）。

2.2  不同浓缩方式的产物回收率

与其他苏云金芽孢杆菌的浓缩试验不同，由NBIM-301的发酵液直接真空薄膜浓缩得到的产物效价相比于离心浓缩处理得到的产物效价（5 233 ITU/mg）稍高一些，这是由于NBIM-301的晶体较小，离心浓缩会损失一部分晶体，而将两种处理方式得到的浓缩液冻干或者喷雾干燥后，前者得到的产物质量要大于后者。不管用什么温度进行蒸发浓缩，所得到的浓缩液的固含量是一致的，仍以1 t发酵液为例，分别计算以真空薄膜浓缩（65 ℃）和离心浓缩两种方式回收到的产物量，结果见表3。由表3可知，采用真空薄膜浓缩方式最终得到的产物质量是离心浓缩方式得到的产物质量的176%，效价回收率提高了36%。

3  讨论

苏云金芽孢杆菌发酵液后处理的核心问题就是将伴孢晶体等杀虫成分及其增效因子与发酵液分离，除去占质量90%以上的水分，得到干燥的工业原粉。为了不破坏发酵液的杀虫活性，浓缩过程要遵循“低温、快速”的原则，而减压浓缩法是在较低温度下将发酵液浓缩到一定体积的方法，正好能够符合该原则和要求，而目前MVR和降膜蒸发器的技术则降低了能耗和提高了效率，促进了该技术的实际应用。从原理上讲，温度越低越有利于伴胞晶体和生物有效物质的回收，但是温度太低则会导致生产效率的降低和成本增加，所以在选择具体工艺时需要综合考虑。而根据本试验研究结果，65 ℃是正好能保证回收效率和效果比较合适的温度，在该温度下最终得到的产物质量是离心浓缩方式得到的产物质量的176%，效价回收率提高了36%。

当然，真空薄膜浓缩也有一些不足之处，一是有效成分含量的下降，二是后续剂型加工会受到影响。这些都需要对工艺进行进一步的优化和改善，以得到最优的工艺。

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