长链非编码RNA与肿瘤关系的研究进展

迟洪辉，邱志刚 综述 孙振青 审校

非编码RNA由于不直接编码蛋白曾经一度被忽略，直到miR-34被发现参与P53通路调节，其在肿瘤的发生、发展中的重要作用才为广大研究者所重视[1]。如果想完全了解恶性肿瘤进展的复杂机制及特点，如肿瘤的转移和耐药性，需要认真分析非编码RNA家族。目前，临床对长链非编码RNA(LncRNAs)在肿瘤中的作用的相关报道仍然有限。笔者对lncRNAs和肿瘤的基础概念，突出显示lncRNAs与肿瘤联系的最新研究进展作一综述。

1 LncRNAs和肿瘤特点

LncRNAs是指不编码蛋白且转录本超过200个核苷酸的RNA分子，于2002年小鼠全基因组cDNA文库的大规模测序过程中被首次发现[2]。它们在基因表达调控中发挥着广泛的作用，并迅速在医学研究中广泛流行。通常lncRNAs采用特异性方式表达在疾病组织或发育阶段，使这些分子成为有意义的治疗靶点[3]。例如，lncRNA可以在细胞中调节基因表达，影响蛋白质定位，并且对于形成细胞亚结构或蛋白质复合物很重要。LncRNAs与蛋白质的相互作用还可以调节蛋白质活性和定位。此外，lncRNAs通过将转录因子募集到其靶基因启动子来调节基因转录，激活基因的表达。因此，lncRNAs与肿瘤的发生密切相关。

2011年，Hanahan和Weinberg[4]发现，肿瘤形成是一个多步骤过程，正常细胞逐渐进化到肿瘤阶段，需要获得特定的能力，才能使正常细胞成为肿瘤细胞。肿瘤细胞的十大基本特征是：(1)自给自足生长信号；(2)抗生长信号的不敏感；(3)抵抗细胞死亡；(4)潜力无限的复制能力；(5)持续的血管生成；(6)组织浸润和转移；(7)避免免疫摧毁；(8)促进肿瘤的炎性反应；(9)细胞能量异常；(10)基因组不稳定和突变。

2 LncRNAs与肿瘤的关系

在过去的十多年，lncRNAs获得了广泛的关注，同样在肿瘤研究领域取得了显著进展，两者的联系也越来越紧密，将lncRNAs引入肿瘤生物学，进一步加强我们对肿瘤原因和后果的思考[5]。

2.1 自给自足生长信号 肿瘤细胞最突出的特征之一是其能够在不受外界刺激的情况下持续增殖。正常细胞严格监督生长促进或抑制因子的产生，以确保严格控制细胞数量，进而保证正常的组织结构和功能。相反，肿瘤细胞通过失调的信号使得其无限增长。文献[6]研究发现，lncRNA GAPLINC表达上调并且与胃癌组织和细胞中的MAPK1表达正相关。另外，lncRNA GAPLINC促进MAPK1的表达，并且lncRNA GAPLINC增强胃癌细胞增殖和细胞周期进程在体外和体内依赖于MAPK1。因此，lncRNA GAPLINC可视为胃癌细胞自身的一个生长信号来促进胃癌细胞的增殖，进而促进胃癌的发展。因此，LncRNA GAPLINC可能是胃癌诊断和靶向治疗的有用生物标志物；但是，需要进一步研究lncRNA GAPLINC调控MAPK1的潜在机制。同样的，在鳞状细胞癌中，主转录因子TP63和SOX2通过直接共同占据其启动子和超增强子元件转录激活lncRNA CCAT1。CCAT1反过来招募TP63和SOX2并形成蛋白质/ RNA复合物，共定位于EGFR超级增强子以激活其转录。这些复杂的调节导致lncRNA CCAT1和EGFR的高表达，通过激活下游MEK/ERK1/2和PI3K/AKT信号促进鳞状细胞癌的进展，鳞状细胞癌是由各器官的鳞状上皮引起的侵袭性恶性肿瘤，例如食道，头颈部，肺和皮肤。因此据此原理可以抑制lncRNA CCAT1的水平，从而使其成为药物治疗鳞癌的生物靶点[7]。

2.2 抗生长信号的不敏感 肿瘤抑制基因的激活取决于外部或内部刺激，进而导致细胞周期停滞或可能诱导细胞衰老甚至凋亡。肿瘤细胞阻止抑癌基因的激活或表达的一个机制就是抑癌基因的完全丧失或导致该基因失活的突变的积累。而癌细胞已经找到通过lncRNA的帮助下来抑制抑癌基因激活的机制。PSF是一种推测的肿瘤抑制蛋白，含有一个RNA结合域和一个DNA结合域。研究发现PSF能中和lncRNA GAPLINC对细胞侵袭的影响。然而，当干扰GAPLINC的表达时，PSF的mRNA和蛋白质水平没有变化。这些结果表明，lncRNA GAPLINC可能通过调节其他因素来影响PSF的生物学功能[8]。当患者发现患有恶性肿瘤时候，大部分肿瘤已处于进展期，未来我们可以在术前新辅助的药物治疗中通过药物调控lncRNA，提高肿瘤的抗生长信号的敏感性，从而抑制肿瘤的生长。

2.3 抵抗细胞死亡 导致细胞死亡的一种机制是凋亡。细胞凋亡可以通过各种外部和内部刺激诱导，并且已经报道高度恶性的肿瘤能够明显减少细胞凋亡。对小鼠乳腺上皮细胞进行了RNA测序，其中一种lncRNA，称为lncRNA-Smad7。lncRNA-Smad7在小鼠乳腺上皮细胞和小鼠乳腺癌细胞中广泛表达。研究显示lncRNA-Smad7在TGF-β信号传导下游充当抗细胞凋亡因子。目前，lncRNA-Smad7已鉴定为小鼠乳腺癌细胞中新的抗凋亡因子，未来可以作为药物靶点进行治疗，但是还无法确定lncRNA-Smad7抗细胞凋亡的具体调控机制[9]。在对骨肉瘤研究中，通过运用流式细胞等技术确定了lncRNA SNHG5通过半光天冬酶途径调节骨肉瘤细胞的凋亡，这表明SNHG5的表达可以影响细胞凋亡及其相关基因和蛋白质的表达[10]。目前研究表明，lncRNA SNHG5在骨肉瘤凋亡发生中起关键作用，表明lncRNA SNHG5可能是骨肉瘤的潜在治疗靶标。综上情况，lncRNA的表达水平与肿瘤细胞是否启动凋亡机制确切相关，因此，我们认为将会是lncRNA作为肿瘤药物生物靶点最重要的突破口，直接打破lncRNA抵抗细胞死亡的机制，精确地运用肿瘤药物通过调控lncRNA引起肿瘤细胞死亡。

2.4 潜力无限的复制能力 与仅能通过有限数量的细胞分裂周期的正常细胞相比，肿瘤细胞显示几乎无限的复制。然而，在正常细胞中，这些端粒重复在每次细胞分裂后缩短，因此端粒DNA的长度决定了细胞分裂周期的数量。肿瘤细胞发现了两种避免端粒丢失的方法：(1)将端粒重复添加到染色体的末端；(2)采用替代延长端粒。端粒酶由催化蛋白TERT和RNA TERC组成。TERC的结构完整性对于调节端粒酶活性的端粒酶全酶的组装非常重要。普遍表达的Hu/ELAV RNA结合蛋白家族成员，已被描述为通过非编码RNA从而调节许多细胞活动并影响更广泛的过程，TERC基因在几种人类肿瘤中被扩增，从而使其成为肿瘤细胞中端粒酶活性治疗抑制药的潜在靶点[11]。抑制肿瘤细胞无限复制的能力，是我们人类攻克肿瘤的重要方向，因此需要我们全力的探索，明确肿瘤细胞无限复制的机制，进而我们通过药物影响其机制，阻断肿瘤细胞的无限复制，来抑制肿瘤生长。

2.5 持续的血管生成 当肿瘤细胞生长和增殖时，肿瘤的体积会增加，这时肿瘤细胞就需要一种诱导血管生成的能力。由肿瘤细胞诱导形成的新血管不仅确保了营养物质和氧气的供应，而且允许肿瘤处置其代谢废物并进入血液。几种lncRNAs被认为是血管发育的调节因子。LncRNA Braveheart通过激活核心心血管基因网络来调节心血管发育, lncRNA Fendrr调节染色质修饰，从而影响心血管系统的发育信号, lncRNA-MIAT参与调节内皮细胞功能和病理性血管发生[12]。在肿瘤进展期间，“血管生成开关”也开启，这导致持续生成新的血管，来帮助维持肿瘤生长。血管形成是肿瘤进展的一大重要因素，根治恶性肿瘤就必须首先明确肿瘤生成之前的血管形成机制，是一重要的生物治疗靶点，如此就可以早期应用肿瘤药物消灭肿瘤[13]。

2.6 组织浸润和转移 通常肿瘤细胞的侵袭-转移级联反应包括多种生物学变化，才能使肿瘤细胞侵入健康组织，然后渗入血液和淋巴管。 文献[14]研究显示，在包括肺癌、子宫内膜间质肉瘤、宫颈癌和肝细胞癌的几种人类肿瘤中，一种lncRNA，即MALAT1皆明显上调。研究者通过RNAi的方法沉默MALAT1的表达，发现沉默后明显抑制了肺癌细胞的转移。与转移相关的基因HM-MR的pre-mRNA和成熟的mRNA的表达量与对照组相比均降低，而CTHRC1、CCT4和ROD1的pre-mRNA的表达水平未发生变化，但成熟的mRNA的表达量降低，结果提示MALAT1既可调控基因转录，又可对转录后进行调控来促进肺癌细胞的转移。肿瘤细胞必须从血管渗入其靶组织，形成微转移，最终形成继发性肿瘤。因此，MALAT1可作为早期肺腺癌患者生存的独立预后参数[15]。同样在肺癌中，长非编码RNA Sox2重叠转录物(Sox2OT)的表达水平也上调，发现Sox2OT直接结合microRNA 132在非小细胞肺癌细胞中，重要的是，miR-132抑制部分逆转了Sox2OT敲低介导的对细胞增殖，迁移，侵袭和上皮-间质转化过程的抑制作用。我们还发现Sox2OT可以调节锌指E-box结合同源框2表达，其在肿瘤细胞增殖和侵袭中起关键作用。因此，Sox2OT是一种非编码致癌基因，未来在对非小细胞肺癌的治疗研究者，我们可能通过抑制Sox2OT的表达，从基因层面消除这种疾病[16]。

2.7 避免免疫摧毁 一些lncRNAs可能参与宿主病原体相互作用，从而改变所产生的免疫反应。免疫系统是肿瘤形成和进展的重要屏障，但是高度免疫原性的肿瘤细胞可以通过使免疫系统失效而避免被免疫系统破坏。例如，IRF4是一种转录因子，与PU.1相互作用，上调几种免疫应答因子的基因表达。IRF4在B和T细胞的成熟和树突细胞的活性中起关键作用，lncRNA PAN影响IRF4激活白细胞介素-4(IL-4)启动子的能力，并被认为抑制IL-4，IL-18和IFNγ的转录，表明lncRNA PAN可以抑制免疫应答基因的表达[17]。在肿瘤的发展过程中，人体免疫系统一直处于应对的状态，可是肿瘤却可以逃避免疫系统的摧毁，因为我们可以通过破坏肿瘤自身抵抗免疫系统摧毁的系统，作为肿瘤药物治疗肿瘤的一大突破点，通过肿瘤药物和自身免疫系统对抗肿瘤。

2.8 促进肿瘤的炎性反应 研究表明在某些情况下，炎性反应明显能够促进初发肿瘤成为完全肿瘤的发展。炎性细胞可释放化学物质，特别是活性氧物质，这些化学物质对附近的癌细胞具有积极的致突变作用，加速了它们向高度恶性状态的转化。王文涛等[18]发现，lncRNAs H19和HULC受到短期和长期氧化应激刺激，能调节炎性反应过程中关键基因的表达;当氧化应激条件下的人肝胆管癌细胞中H19和HULC分别被降低时，它们的靶基因IL-6和CXCR4均被下调，而IL-6和CXCR4的强制表达在促进胆管癌细胞中的细胞迁移和侵袭中与H19和HULC发挥类似的作用，表明炎性反应和氧化应激之间存在正反馈回路，用lncRNA激活这种反馈环可能促进胆管癌的发生。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富的炎性浸润物，并且有助于淋巴结转移。然而，肿瘤相关巨噬细胞诱导的淋巴结转移的确切机制仍然很大程度上未知。最新研究发现，lncRNA LINC01296被称为淋巴结转移相关转录物1(LNMAT1)，其表达与膀胱癌的瘤内和肿瘤周围区域的巨噬细胞浸润强度正相关，表明LNMAT1诱导的肿瘤相关巨噬细胞浸润与膀胱癌淋巴管生成之间存在潜在联系。这些发现为LNMAT1调节的淋巴转移肿瘤微环境提供了可能的机制，并提示LNMAT1可能代表淋巴结转移性膀胱癌临床干预的潜在治疗靶点[19]。

2.9 细胞能量异常 Otto Warburg首先观察到肿瘤细胞能量代谢的异常特征：即使存在氧气，肿瘤细胞也可以通过将其能量代谢主要限制在糖酵解中来重新编程它们的葡萄糖代谢，从而重新编程它们的能量产生，从而导致被称为“有氧糖酵解”的状态。最新研究证明，一种lincRNA，lncRNA NRCP在卵巢肿瘤中高度上调，与对照肿瘤细胞相比，NRCP的敲低导致细胞凋亡显著增加，细胞增殖减少和糖酵解减少。它能通过NRCP作为STAT1和RNA pol II之间的中间分子参与了癌细胞的糖酵解调节的能量代谢，增强了它们之间的相互作用，从而导致STAT1转录编程增加，进而影响癌细胞的凋亡和增殖[20]。能量代谢是人体中重要的新陈代谢活动，对肿瘤细胞造成的能量异常，在未来我们作为生物靶点进行药物研发时，我们要更加精确的了解肿瘤细胞能量异常的机制，从而达到精准治疗的要求[21]。

2.10 基因组不稳定和突变 肿瘤细胞基因组的分子遗传分析进展为功能突变和肿瘤进展期间持续的基因组不稳定提供了最有说服力的证据[22]。在获得肿瘤发生所需的突变基因的过程中，肿瘤细胞通常会增加突变率。染色体8q24的基因组区域经常被扩增改变，容易突变，最近研究显示，lncRNAs包括CCAT1, CCAT2,CARLO-5,PVT1,PCAT1和PRNCR1转录自此基因组区域。这些lncRNAs中的一些(例如CCAT1和CCAT2)会调节MYC表达。我们从结肠直肠癌中的lncRNA CCAT2和前列腺癌中的lncRNA PCAT-1中了解到的，从8q24位点转录的lncRNAs可能影响双链DNA断裂修复和染色体不稳定性，从而在促进肿瘤发病机制中发挥更广泛的生物学效应[23]。基因组学是目前基因研究的综合目标，而肿瘤细胞基因组的不稳定和突变与lncRNAs的关系正是我们生物治疗全新热点，是药物治疗肿瘤的最可能的突破点。

3 问题与展望

目前，肿瘤治疗受到许多困难的严重阻碍。早期诊断对肿瘤的治疗和预后至关重要。因此，肿瘤早期诊断标志物是临床研究的热点[24]。与蛋白质编码基因相比，lncRNAs的研究尚处于起步阶段。然而，随着高通量测序技术的迅速发展，大规模lncRNA cDNA文库的建立和基因芯片技术的成熟应用，大量的lncRNAs被发现，其作用机制的研究也取得了一定的进展[25]。一方面，lncRNAs与多种生物学过程有关，包括细胞周期、增殖、代谢、重编程和多能性[26]。另一方面，lncRNAs的失调涉及多种人类疾病的发展和进展，特别是在肿瘤中[27]。由于上述两点，研究人员可能会将lncRNAs作为诊断性生物标志物或肿瘤的治疗靶点。然而，在我们能够利用这些新的治疗选择之前，需要进行更多的功能和结构研究才能充分理解lncRNAs的生物学。现在，我们只是走在了解lncRNAs作用的第一步。

随着着研究不断发展，我们将发现新的lncRNAs，并更多地了解它们与肿瘤特点联系的重要性，这将帮助我们设计出更好的治疗药物。总之，lncRNAs在生物医学中的潜在作用可能是巨大的，需要经过长时间的深入研究才能被完全解读和应用。