TLR4/MyD88信号通路在卵巢癌紫杉醇化疗抵抗中的研究进展

王安凤,潘 晨,童晓文

1.同济大学附属同济医院妇产科,上海 200065 2.江苏省人民医院溧阳分院妇产科,溧阳 213300

近年来,肿瘤已成为现代社会威胁人类生命最严重的疾病之一,癌症是发展中国家首位死因,WHO预测全球癌症死亡在2007—2030年将增加45%,2030年将有癌症新发病例2 640万例,死亡1 700万。上皮性卵巢癌是美国女性癌症第5位死因,2017年有超过14 000死亡人数[1].卵巢癌由于发病率高、病程隐匿、早期诊断困难、总体预后不良等特点,导致其对女性的健康及生命带来了严重威胁,它的治疗方法是肿瘤细胞减灭术加术后系统的TC方案化疗,但80%的卵巢癌患者在1～2年内复发,晚期卵巢癌的5年生存率长期滞留在30%左右,无明显改观。一方面手术的彻底性至关重要,但是50%ⅢC期及Ⅳ期患者很难达到满意的无肉眼残留病变。随后提倡的术前给与新辅助化疗,预后仍无明显改善。原因很多,其中主要还是化疗药物耐药的问题,故寻找敏感的化疗方案及解决卵巢癌化疗耐药的问题迫在眉睫。

紫杉醇作为卵巢癌化疗的一线用药,其抗肿瘤的机制主要是“冻结有丝分裂”使肿瘤细胞停止在G2期和M期,直至死亡;另外,紫杉醇也可作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体,对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用[2]。近年研究发现紫杉醇是Toll受体4(TLR4)的主要配体之一,可以通过TLR4/髓样细胞分化因子88信号通路促进卵巢癌细胞增殖和抗凋亡作用,也就是在特定的情况下,紫杉醇对于卵巢癌细胞具有促凋亡和抗凋亡的双重作用[3-6].

1 TLR4/MyD88信号通路作用机制

1.1 TLR4的生物学特性

TLR4是由胞外区、跨膜区和胞内区三个部分组成的Ⅰ型跨膜蛋白,其胞外区结构由富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats,LRR)组成,TLR胞内区结构与白介素L受体1的保守区域相似,称为TIR区(TLRVIL,R1 homologous region)[7],跨膜区是富含半胱氨酸的结构域。TLR4可识别多种配体,最主要的是来自革兰阴性菌细胞壁的LPS,研究发现紫杉醇也是可被其识别的非病原体相关分子模式(PAMP)分子[8],能激活MyD88依赖性、MyD88非依赖性通路即TLR相关的干扰素活化子(TIR domain containing adaptor protein inducing interferon-β,TRIF)依赖信号转导途径,从而诱导肿瘤细胞释放多种因子或上调抗凋亡信号等一系列效应。

高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)是近年备受关注的TLR4内源性配体之一,不断增加的证据显示,紫杉醇和(或)LPS诱导受损组织或坏死细胞释放HMGB1,并通过RACE或TLR4信号通路继而介导自噬和释放多种细胞因子[9]。

1.2 髓样细胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)的生物学特性

MyD88[10]是含有TLR结构域的接头蛋白,在TLR信号通路中有关键性的作用,其N端的死亡区(death domain,DD)与白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor associate kinase,IRAK)的死亡结构域相结合,并引起IRAK的自身磷酸化,最终引起炎性细胞因子的合成和释放,从而诱发机体本身的炎症反应过程。

1.3 TLR4/MyD88信号通路

目前主要根据接头蛋白不同,分为MyD88依赖性途径和非MyD88依赖性途径。

1.3.1 MyD88

依赖性信号转导途径是TLR信号转导的共同通路(TLR3除外),MyD88依赖性途径主要包括两种作用方式:NF-kB和JNK/SAPK,具体过程为:当TLR与PAMPs或紫杉醇结合后,受体发生二聚化,此时胞质中Toll的结构域与MyD88的羧基末端相互作用,MyD88用它的DD募集下游同样含死亡作用域IRAK家族相结合,导致IRAK自身磷酸化,磷酸化的IRAK脱离MyD88与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6, TRAF6)结合,TRF6活化引起上述两条不同途径的信号转导。

1.3.2 在MyD88

非依赖性途径中,能够激活干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)和TANK联合激酶1(TANK binding kinase 1, TBK1)等信号转导分子,最终诱导干扰素β(interferon-β,IFN-β)的表达。研究表明,该通路也可导致NF-kB和MAPK的激活[8]。

2 TLR4/MyD88信号通路与卵巢癌

2.1 TLR4/MyD88信号通路在卵巢癌细胞中的表达

现认为,在卵巢癌细胞表面TLR4/MyD88的表达可促进肿瘤细胞的免疫逃逸,同时参与细胞凋亡及肿瘤细胞化疗耐药。朱熠等[11]通过研究109例卵巢组织石蜡包埋组织标本研究卵巢癌TLR4/MyD88信号通路的表达及临床预后相关性,其结果表明发现TLR4在卵巢良恶性细胞中均有表达,但在恶性细胞中染色强度明显增高,且MyD88+的卵巢癌患者较不表达者DFS及OS明显缩短。

2.2 TLR4/MyD88信号通路与卵巢癌复发及紫杉醇耐药的关系

作为卵巢癌一线用药的紫杉醇,其耐药的过程是一个多因素、多途径、多层次相互作用的结果[12]。Wang等人研究发现下调卵巢癌细胞中的TLR4的表达可下调XIAP和pAkt的表达,恢复紫杉醇对SKOV3细胞增殖的抑制作用,阻碍癌细胞周期进程[13]。鉴于炎症与肿瘤关系密切,目前研究发现介导慢性炎症反应的Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)及其衔接蛋白MyD88起到了至关重要的作用[14-15]。以下主要从炎症微环境[3]、凋亡抑制、免疫抑制3个方面综述[5]:

2.2.1 TLR4/MyD88激活导致的炎症微环境改变

研究发现,炎症在恶性肿瘤发生、发展等方面发挥重要作用,肿瘤细胞、周围正常的宿主基质细胞和浸润的炎性细胞共同组成一个整体——肿瘤微环境。目前已证明在肿瘤中促进炎症发生的重要因素包括自由基、细胞因子和转录激活因子-3(STAT-3)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)、VEGF以及HMGB1等[16]。IL-6属于微环境中最常见的促进获得性免疫的细胞因子。Wang等研究说明卵巢癌细胞分泌的IL-6、IL-8可能是卵巢癌对传统化疗药物产生抵抗的原因,其机制主要是下调细胞凋亡蛋白酶caspase-3的蛋白水解活性。其次IL-6、IL-8诱导的化疗抵抗与多耐药基因(MDR和GSTpi)、细胞凋亡抑制蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、XIAP)的增加有关,还涉及到Ras/MEK/ERK和PI3K/Akt的活化。HMGB1是一种广泛存在于真核生物细胞内,富含电荷的非组蛋白染色质核蛋白,其在压力条件下(氧化压力及炎症反应等),会主动或被动释放到胞外,胞外HMGB1可参与NF-kB通路释放促炎性细胞因子、趋化因子、血管生成因子等,参与形成炎性微环境。此外还能介导中性粒细胞胞外诱捕网的形成(neutrophil extracellular traps, NETs)[17]。

另外有研究显示,COX-2在卵巢癌中高表达,其表达水平与卵巢癌的分型、分化程度、转移密切相关[18]。Rouba等[19]为探究COX-2在晚期卵巢癌中与肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管生成及生存率的关系,使用免疫组化的方式检测118例晚期卵巢癌病人的COX-2、Ki-67、VEGF、和bcl-2的表达情况,结果也证实了环氧合酶-2的表达与肿瘤增殖和肿瘤血管生成有关。COX-2主要是通过前列腺素(PGs)起作用,通过影响细胞周期,还能抑制细胞凋亡和增加VEGF的表达,增减微血管密度(MVD),促进新生血管的生成,起到促进肿瘤生长和转移的效果[20]。

2.2.2 TLR4/MyD88的凋亡抑制作用

survivin特异性表达于细胞的G2/M期,是目前抑制作用最强的凋亡抑制蛋白,其与卵巢癌细胞生长、侵袭转移和耐药密切相关。为探索survivin在卵巢癌预后中的作用,Athanassiadou等[20]选取100例卵巢癌标本进行免疫细胞学染色检测survivin的表达情况,结果发现survivin的表达与肿瘤恶性程度及细胞学分级呈正相关(P<0.0001)。在抑制细胞凋亡的过程中,survivin通过线粒体细胞色素C的释放,直接抑制下游凋亡效应因子caspase-3和caspase-7的作用[21]。另外,survivin表达异常增高促进VEGF等促血管生成因子的表达,有研究[8,22]发现血管生成素(angiopoietin, Ang)II的作用依赖于survivin的表达上调,其通过survivin抑制Caspase-3来调节肿瘤血管生成。

血管内皮生长因子(VEGF)是促进肿瘤血管形成的主要因子,在卵巢癌恶性肿瘤中异常高表达,其作为贯穿血管通透性的初始诱导到内皮细胞的增殖、迁移和存活等许多步骤的关键驱动因素[15]。卵巢癌组织缺氧能刺激产生更多的VEGF[23],另外紫杉醇能直接激活TLR4/MyD88信号通路或通过上调HMGB1的表达促使VEGF产生和内皮细胞增殖,VEGF能通过PI3K/Akt信号通路诱导survivin的表达,从而导致化疗耐药。

X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)属于凋亡抑制蛋白, Miyamoto等[24]研究发现高表达于卵巢癌细胞中,其过表达与肿瘤的进展、复发、预后以及耐药密切相关[25]。XIAP通过抑制caspase-9、caspase-3和caspase-7的活性、激活核因子kB(NF-kB)、与磷脂酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路相互作用、作用于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)阻碍细胞凋亡[26]。邹冬玲等[27]为研究MyD88在卵巢癌中的耐药机制,研究发现MyD88蛋白通过调节PKB/Akt信号通路、XIAP以及MDR1表达参与对卵巢癌对紫杉醇的耐药性。另外,紫杉醇结合TLR4/MyD88通路启动PI3K/Akt生存途径的同时激活NF-kB及其核转移,促使卵巢癌细胞释放炎症因子IL-6和诱导凋亡抑制蛋白表达;王丹等[28]利用构建内源性过表达的IL-6的人卵巢癌A2780细胞系和内源性抑制IL-6表达的人卵巢癌SKOV-3细胞,与Duan[29]等在非小细胞肺癌中的研究结果相似,证实了IL-6也可激活PI3K/Akt信号通路增强卵巢癌细胞细胞的黏附和侵袭能力以及抗凋亡作用,如此恶性循环最终引起卵巢癌抗凋亡。

2.2.3 TLR4/MyD88与免疫抑制

大量证据表明,卵巢癌是免疫源性肿瘤[30],癌细胞异常高表达免疫抑制相关分子,如Toll样受体4(TLR4)、MyD88、吲哚胺2/3-双加氧酶1(IDO1)、PD-L1、PD-1以及芳香烃受体(AHR),此外还表达分泌可溶性免疫抑制相关因子,如白细胞介素(IL)-6、转化生长因子β1(TGF-β1)等。导致卵巢癌免疫抑制或逃逸的因素包括卵巢癌细胞诱导的调节性T淋巴细胞(Treg)[4]、浆细胞样DC(pDC)、髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs),它们被募集到卵巢组织中,形成卵巢癌免疫抑制微环境;此外,卵巢癌细胞分泌的可溶性免疫抑制因子,抑制了局部抗原提呈细胞(APC)的成熟,抑制APC有效提呈肿瘤抗体,阻断T细胞、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞等的抗瘤活性,抑制机体免疫和CTL细胞毒效应,导致免疫细胞不能识别靶细胞或免疫功能不全[31]。其机制主要是卵巢癌细胞通过TLR4-髓样分化因子(MD2)复合物介导的MyD88依赖的PI3K/蛋白激酶B(Akt)/核因子kB(NF-kB)信号通路活化,促进IL-6、TGF-β1和IL-17A的表达和分泌,诱导IDO1高表达及其色氨酸代谢产物犬尿氨酸(KYN)产生,并诱导Treg细胞CD4+CD25+叉头蛋白P3(Foxp3)的表达,抑制巨噬细胞的功能和DC的活性,降低T淋巴细胞的增殖反应和细胞毒性作用,Foxp3也能调节Treg的功能和表达[32]。MyD88+卵巢癌细胞表达和分泌IL-6,对IDO1和AHR活化起到了决定性作用,AHR的内源性配体KYN,可诱导免疫耐受性DC和Treg的产生。另外,通过KYN活化的AHR作为转录因子又进一步促进了IL-6的转录表达,形成IL-6/IDO1/KYN/AHR/IL-6信号通路的回路。新近研究还显示IL-6通过酪氨酸蛋白激酶(JAK)/信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号通路的活化,上调PD-1并降低免疫抑制的作用。卵巢癌主要通过MyD88/IDO1/KYN/AHR信号通路的活化以及IL-6/IDO1/KYN/AHR/IL-6信号通路回路形成免疫抑制微环境,最终导致免疫抑制或免疫逃脱[33]。

3 总结

综上所述,卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤中预后最差的一种,患者生存质量差,5年OS率低。因此,亟待寻求方法提高卵巢癌患者的临床治疗疗效及生存质量。随着医疗的进步,卵巢癌化疗紫杉醇抵抗是目前认为其死亡率高的主要原因,研究证实当紫杉醇刺激表达与卵巢癌细胞表面的TLR4/MyD88通路激活NF-kB通路或Akt生存途径,从而诱导肿瘤细胞释放多种促炎因子、凋亡抵抗以及免疫抵抗,其相互作用,最终导致免疫逃逸和化疗失败。在上述机制的共同作用中TLR4/MyD88信号通路及其负调控策略成为研究热点。根据上述机制,一方面可考虑靶向阻断通路,如针对TLR4通路的不同阶段,可将现有的负调控因子分为三类:一是TLR4表达抑制剂,如阿托伐他汀等;二是TLR4二聚体化抑制剂,如MPLA、姜黄素等;三是TLR4通路分子抑制因子,如Gas6、Traid3A等。另一方面,可通过免疫治疗,如阻断导致卵巢癌免疫逃逸的通路、杀伤细胞(CIK细胞)回输、树突状细胞-杀伤细胞(DC-CIK细胞)疗法以及自然杀伤细胞(NK细胞)疗法。另外,有研究表明,COX-2抑制剂能抑制肿瘤细胞产生血管内皮生长因子(VEGF)的表达[34],各种促炎性因子及免疫抑制因子之间相互作用,其过表达在卵巢癌细胞生长、凋亡、肿瘤浸润转移、肿瘤血管生成及肿瘤化疗耐药产生相关,使用相关抑制剂改善卵巢癌进展及化疗敏感性,也可考虑通过下调抗凋亡蛋白如survivin表达恢复化疗敏感性。对于卵巢癌抗凋亡微环境分子之间的内在联系及相互作用仍需要深入研究,认识卵巢癌免疫抑制的分子机制、寻找卵巢癌靶标分子、选择卵巢癌高效的治疗方案,这对于改善卵巢癌预后具有重要意义。