基于硼氮共掺杂荧光碳点定量分析吡罗昔康

吴 青，金 星，王忠霞，王 伟

(1.盐城市第三人民医院，江苏 盐城 224001;2.盐城工学院 化学化工学院，江苏 盐城 224002)

吡罗昔康(PRX)，又称安尔克或吡氧噻嗪，学名2-甲基-4-羟基-N-(2-吡啶基)-2H-1,2-苯并噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，是一种典型的非甾体类抗炎镇痛药[1]。在临床上被广泛用于治疗许多疾病，如类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎和急性疼痛等[2]。但是，一日内服用PRX超过20 mg将会产生一系列副作用，如头痛、头晕、耳鸣及胃溃疡等[3-4]。因此，为了有效控制药物用量，建立快速有效的PRX检测传感技术显得尤为重要。目前，检测PRX有多种方法，如高效液相色谱法(HPLC)[5]、分光光度法[6]、伏安法[7]、毛细管电泳法[8]等。尽管这些方法具有较高的灵敏度，但是也存在检测耗时较长、前处理过程复杂、仪器设备昂贵且操作要求较高等问题[9]。因此，寻求一种简单、灵敏、选择性高的检测方法具有重要的研究意义。

荧光碳点(CDs)作为一种新型的荧光纳米材料，因其独特的光学特性、物理化学性质、良好的生物相容性和较高的光学稳定性等优点，已成为生物医学和传感应用等领域的明星材料[10-11]。研究表明，相对于传统的荧光CDs，杂元素掺杂的荧光CDs在光学性质、物理化学性能以及量子产率等方面都会得到明显的改善，因此在实际样品检测中具有更高的实用价值[12-15]。例如，Chen等[16]以乳糖为原材料成功地合成了荧光碳点，进行叶酸定量检测，其线性范围在8×10-8～6×10-5mol/L，进一步评估了荧光碳针检测人体尿液样本中叶酸的实用性。Niu等[17]以水溶性胺包覆碳点为基础，利用苦味酸(PA)与碳点表面的阴阳离子对产生的强静电相互作用建立了一种简单、低毒的PA纳米传感器，其胺包覆碳点在水溶液中对PA的检测限约为1×10-6mol/L。Das等[18]通过在碳点中掺入氮和硫，合成具有高量子产率(69.27%)的掺杂碳点，硫和氮的协同作用为荧光探针提供了优异的发光性能，为检测有机分子丙酮提供了识别位点，其最低检测限为7.2×10-7mol/L。尽管掺杂碳基纳米材料作为荧光探针已经被广泛地应用于传感体系，但是这些荧光CDs发射位置大多位于短波区域，因此，结合碳点无毒性可应用于细胞等生物组织成像的特点，寻求制备一种长余辉发射的荧光CDs材料成为一个亟待解决的问题。

本研究中，我们以邻苯二胺、谷氨酸及硼酸为前躯体，通过简单的一步水热法成功制备硼氮共掺杂荧光碳点(B,N-CDs)。研究表明，B,N-CDs具有较好的分散性、优异的水溶性和突出的光学及物化性能，且B,N-CDs在长波长区域发射(λex=650 nm，λem=700 nm、731 nm)，研究过程中发现PRX可以有效地淬灭B,N-CDs的荧光，具体合成及淬灭过程如图1所示。

图1 合成B,N-CDs及检测吡罗昔康的原理图Fig 1 Schematic diagram of synthesis B,N-CDs and detection of piroxicam

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

实验中使用的所有化学试剂均为分析纯。其中，邻苯二胺(C6H8N2)、谷氨酸(C5H9NO4)、硼酸(H3BO3)、吡罗昔康(C15H13N3O4S)购自国药集团化学试剂有限公司，甲醇购自上海阿拉丁化学试剂有限公司，实验用水为二次蒸馏水。

实验仪器:紫外—可见分光光度计(UV-Vis)，UV-2450，Shimadzu，Japan；荧光光谱仪(配备1 mL石英比色皿)，Fluormax-4，Horiba，USA；透射电子显微镜(TEM)，JEM-2010，JEOL，Japan；傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)，Nicolet-5700，USA。

1.2 硼氮共掺杂碳点的制备

以邻苯二胺、谷氨酸和硼酸作为碳源、氮源和硼源，利用简便的水热法合成双发射硼氮共掺杂的荧光碳点(B,N-CDs)[19]。具体实验步骤如下：将0.11 g邻苯二胺、0.11 g谷氨酸和0.055 g硼酸溶于5 mL甲醇，避光超声30 min形成均匀溶液；然后将上述5 mL混合溶液转移至聚四氟乙烯(Teflon)作为内衬的高压反应釜(30 mL)中，180 °C下加热反应16 h，反应结束后自然冷却至室温；最后，在10 000 r/min的条件下离心30 min去除大颗粒，收集上清液得到黄褐色的B,N-CDs，置于冰箱中保存待用。

1.3 吡罗昔康(PRX)的检测

吡罗昔康(PRX)定量检测的步骤如下：在12个1.5 mL离心管中分别加入10 μL B,N-CDs、50 μL PBS缓冲液(pH 7.0)及不同浓度的PRX标准溶液，加二次蒸馏水定容至500 μL，漩涡仪搅拌几秒钟静置反应30 min，在650 nm的激发波长条件下，通过荧光光谱研究不同浓度的PRX标准溶液在相同条件下的荧光变化。激发和发射波长的狭缝宽度均为5 nm。

1.4 选择性研究

在选择性实验中，将10 μL B,N-CDs和50 μL PBS缓冲液(pH 7.0)分别置于14个1.5 mL离心管中，然后依次加不同种类的干扰物质，包括L-半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、多巴胺(Dop)、葡萄糖(Glu)、乳糖(Lactose)、肾上腺素(Adrenaline)、卡托普利(Cap)、6-巯基嘌呤(6-MP)、抗坏血酸(AA)、茶多酚(GTP)、尼美舒利(Nim)、阿昔洛韦(Acy)、蔗糖(Sucrose)和腺苷三磷酸(ATP)，孵化几分钟后用二次蒸馏水定容至500 μL。在激发波长650 nm，狭缝均为5 nm条件下测定荧光图谱。其中PRX、GTP和Acy的浓度为2×10-4mol/L，其他干扰物的浓度为3×10-4mol/L。

1.5 实际样品检测

抽取市售相同的PRX片(10片)，用研钵将其研磨均匀，准确称取0.0331 g PRX粉末用10 mL乙醇溶解，用二次蒸馏水定容至100 mL。采用标准加入法进行实样测定，在3个1.5 mL离心管中分别加入10 μL B,N-CDs、50 μL PBS缓冲液(pH 7.0)及不同体积的上述配置溶液，加二次蒸馏水定容至500 μL，漩涡仪搅拌几秒钟后静置反应30 min，在650 nm的激发波长条件下，通过荧光光谱研究不同浓度的PRX在相同条件下的荧光变化。激发和发射波长的狭缝宽度均为5 nm。

2 结果与讨论

2.1 碳点的表征

为了研究碳点的形貌，采用TEM对B,N-CDs颗粒形貌进行表征,如图2所示。由图2a可知,该碳纳米材料由碳点聚集组成且呈团聚状态，在电子束下表现出很好的稳定性。为了进一步研究该碳点的组成结构，对a图中矩形部分材料进行放大，结果如图2b所示。发现该聚集材料由粒径约20 nm的B,N-CDs聚集而成。应用EDS对其进行元素组成分析，分析结果如图2c所示。数据结果表明B,N-CDs主要有B、C、N、O等4种元素组成，说明通过简单的一步水热合成技术成功合成了硼氮共掺杂的碳基荧光纳米材料。

图2 B,N-CDs的TEM图(a,b)和EDS图(c)Fig 2 TEM diagram (a,b) and EDS diagram (c) of B,N-CDs

使用FT-IR对B,N-CDs的表面状态进行表征，如图3所示。在3191 cm-1处的宽吸收带是-OH伸缩振动峰或N-H伸缩振动峰[20-21]，1 685 cm-1处的吸收峰是C=O伸缩振动峰[22]，1 395 cm-1和1 255 cm-1处的吸收峰归因于C-N/B-N和B-C的弯曲振动[23-24]，748 cm-1处的吸收峰归因于苯环上Ar-H的弯曲振动。FT-IR结果表明，B,N-CDs表面含有大量的羧基、氨基及含硼羟基等亲水基团，直接为B,N-CDs具有良好的水溶性提供了证据。

图3 B,N-CDs的红外光谱图Fig 3 Infrared spectrogram of B,N-CDs

2.2 碳点光学性质研究

不同激发波长下B,N-CDs的荧光发射图谱如图4所示。由图4可以看出，随着激发波长的增加，碳点发射峰的位置并没有随之改变，且在激发波长增加到650 nm时，发射峰值强度达到最大。随着激发波长的继续增大其荧光强度逐渐减小，表明B,N-CDs的发射光谱并不依赖碳点的激发波长。这可能是由于碳点尺寸分布均匀导致的[25]。B,N-CDs的紫外—可见吸收光谱和荧光光谱如图5所示，由图5中的曲线a可以看出，B,N-CDs在250 nm、271 nm处有明显的特征吸收峰，是由C-C键的π-π*跃迁引起的[26];在374 nm处有一小的吸收峰，是由掺杂元素引起的n-π*跃迁[27]。由图5中的曲线b可以看出，所制备的B,N-CDs在长波区域具有很明显的长余辉发射。

2.3 传感机制的研究

使用荧光光谱研究PRX对B,N-CDs的荧光淬灭效果，结果如图6所示。结果表明，PRX可以有效地淬灭B,N-CDs的荧光。由图6中的曲线b可知，当加入1×10-4mol/L PRX后，60%的B,N-CDs荧光强度被PRX淬灭，说明可以利用制备的B,N-CDs定量检测PRX。为了进一步探索PRX对碳点的荧光淬灭机理，使用紫外光谱对其进行研究，结果如图7所示。实验表明，单纯的碳点和加入PRX的碳点的紫外—可见光图谱并没有明显改变，说明加入PRX分子并没有改变B,N-CDs的分子结构，仅是通过简单的电子或者能量转移使其荧光发生淬灭[28]。

图4 不同激发波长下B,N-CDs的荧光发射图谱Fig 4 Fluorescence emission spectra of B,N-CDs at different excitation wavelengths

图6 B, N-CDs对PRX的荧光响应图谱Fig 6 Fluorescence response spectra of B,N-CDs for PRX

图5 B,N-CDs的紫外—可见吸收光谱和荧光光谱Fig 5 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of B, N-CDs

图7 B, N-CDs对PRX的紫外响应图谱Fig 7 UV-Vis response spectra of B,N-CDs for PRX

2.4 PRX定量检测

基于上述研究结果，利用B,N-CDs对PRX进行定量检测。B,N-CDs荧光强度与PRX浓度的变化关系如图8所示。由图8可以看出，随着PRX标准溶液浓度的不断增加(0～5×10-4mol/L)，B,N-CDs的荧光强度逐渐降低。说明B,N-CDs对PRX的检测具有较高的灵敏度。实验中相对荧光强度与PRX浓度的线性关系如图9所示。由实验结果可知，B,N-CDs对PRX的定量检测在2×10-7～1.5×10-4mol/L的浓度范围内具有良好的线性关系，在3倍的标准偏差下测量，得到PRX的最低检测限为5.7×10-8mol/L，与其他文献中的PRX最低检测限相比要低得多[29-32]。

2.5 干扰实验

除了灵敏度，选择性是衡量荧光探针优劣的重要因素之一。为了研究B,N-CDs荧光探针的选择性，在最佳的实验条件下，分别加入潜在的不同种类的干扰物质,包括Cys、GSH、Dop、Glu、Lactose、Adrenaline、Cap、6-MP、AA、GTP、Nim、Acy、Sucrose和ATP,对其选择性进行研究。其中，PRX、GTP和Acy的浓度是2×10-4mol/L，其他干扰物的浓度均为3×10-4mol/L。实验结果如图10所示,从图中可以看出，B,N-CDs对PRX具有较高的选择性，这主要是由于B,N-CDs具有特异性结合PRX的活性位点，而与其他干扰物没有明显特异性反应的结果。

图8 B,N-CDs对不同浓度PRX的荧光响应图谱Fig 8 Fluorescence response of B,N-CDs for different concentrations of PRX

图9 B,N-CDs相对荧光强度与PRX浓度的线性关系图Fig 9 Linear relationship between the relative fluorescence intensity of B,N-CDs and PRX concentration

图10 B,N-CDs对不同干扰物质的荧光响应图谱及其对应的柱状图谱Fig 10 Fluorescence response spectra of B,N-CDs for different interfering substances and their corresponding column patterns

2.6 实际样品检测

为了验证设计合成的B,N-CDs荧光探针的实用性，选择市售的PRX作为实际样品进行分析，药物样品中PRX的测定结果如表1所示。可以看出，本方法对PRX的加标回收率在94.3%～103.3%之间，相对标准偏差在2.69%～4.54%之间，表明该方法对于检测实际样品中的PRX具有一定的可行性。

表1药物样品中PRX的测定结果
Table1Determination results of PRX in pharmaceutical samples

样品药片含量(±SD)a/(10-6mol·L-1)加入含量a/(10-6mol·L-1)检测含量(±SD)a/(10-6mol·L-1)回收率a/%相对标准偏差(n=5)a/%110.9±1.0510.019.7±1.2694.32.69210.3±1.0220.031.3±0.88103.34.54310.6±1.03100.099.2±0.10598.53.72

注：回收率测定时要使被测PRX的含量在2×10-7～1.5×10-4mol/L范围内；a每一个数据平行测定3次；SD为标准差。

3 结论

通过简单的一步水热法成功制备了硼氮共掺杂碳点B,N-CDs。采用B和N原子掺杂很大程度上改善了碳点的电子性质和表面化学活性。实验结果显示B,N-CDs作荧光探针对PRX具有很高的灵敏度，其最低检测限为5.7×10-8mol/L，这一结果优于当前的大多数PRX分析方法。因此，基于B,N-CDs构建的PRX传感器具有高选择性、高灵敏性的优点。同时，其在市售PRX药物测定中的成功应用，进一步验证了该传感器具有较好的应用前景。