16S rRNA 基因测序在儿童骨感染病原菌诊断中的临床价值

干驰 曹清 莫茜 陶悦

儿童软组织、骨关节感染较少，但由于其免疫系统发育不成熟、免疫功能尚不完善，一旦发生感染，轻则延长疗程，增加患儿痛苦，重则引起相关急性并发症[1]。因此，病原菌的快速、准确鉴定对儿童骨科感染诊断及治疗具有重要意义。虽然传统培养法仍然是目前诊断细菌感染的“金标准”，但其阳性检出率不高、检测时间过长，无法完全满足临床早期、快速诊断以指导治疗的需要[2]。16S rRNA 基因是细菌编码 16S rRNA 的 DNA 序列，广泛存在于所有细菌基因组中，每个细菌含 5～10 个拷贝。16S rRNA 含有约 1500 个核苷酸，具有“种”间多态性、高度的特异性和保守性，因此，利用 16S rRNA 基因序列分析能够鉴定到属或种的水平[3-4]。聚合酶链式反应 ( polymerase chain reaction，PCR ) 具有简便、快速、高敏感性及特异性等特点，在细菌检测中得到了广泛应用[5-6]，可快速检测生化反应不典型、生长缓慢或难以培养的细菌[7]。本研究通过比较分析 16S rRNA 基因测序与临床传统培养结果，以探讨 16S rRNA 基因测序应用于儿童骨感染性疾病病原菌快速诊断的临床价值。

材料与方法

一、一般资料

选择 2015 年 12 月至 2018 年 1 月间于上海儿童医学中心骨科住院治疗、临床考虑骨感染的样本，同时进行 16S rRNA 基因测序和传统细菌培养。患儿年龄＜18 岁，且患儿家属对本研究知情，并签署知情同意书。

二、实验方法

1. 实验试剂与仪器：基因组 DNA 抽提试剂盒购自德国 Qiagen 公司 ( QIAamp®DNA Mini Kit，Cat No 51306 )；PCR 试剂 ( Ex Taq®Hot Start Version，Code No RR006A ) 和 DL2000 DNA Marker ( Code No 3427A )均购自日本 TAKARA 公司；Veriti®热循环仪 ( 美国Applied Biosystems 公司 )；凝胶成像仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 )；Vitek 全自动细菌分析仪及 API 鉴定系统 ( 法国生物梅里埃公司 )。

2. 引物的选择：选用细菌 16S rRNA 基因通用引物 ( 27F：5’-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ )，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

3. 基因组 DNA 的提取：采集的骨科临床样本按Qiagen 公司基因组 DNA 提取试剂盒操作说明书进行处理。

4. 16S rRNA 基因的 PCR 扩增：PCR 反应体系( 25 μL )：27F ( 10 μmol / L ) 及 1492R ( 10 μmol / L )各 1 μL、DNA 模板 2 μL、TaKaRa Ex Taq HS ( 5U /μL ) 0.2 μL、10×Ex Taq Buffer ( 20 mM Mg2+ plus )2.5 μL、dNTP Mixture ( 各 2.5 mM ) 2 μL、加入灭菌去离子水 16.3 μL。PCR 反应条件为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性 20 s，60 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸90 s，共 35 个循环；72 ℃ 5 min。

5. PCR 产物电泳及测序：取 PCR 产物 5 μL 于 1%琼脂糖凝胶电泳。Gel-red 染色后通过凝胶成像仪观察，PCR 阳性产物送北京六合华大基因科技有限公司纯化后测序，使用 27F 和 1492R 引物双向测序。

6. 测序结果分析：将测序所得序列与美国国家生物技术信息中心 ( National center for biotechnology information，NCBI ) 数据库进行同源性比对，获得种属信息。

7. 传统微生物培养：进行 16S rRNA 基因测序的样本同时进行传统培养，由上海儿童医学中心微生物室专业人员采用 Vitek 全自动细菌分析仪及 API鉴定系统，按照常规方法对病原菌进行分离培养鉴定，严格按照实验室检测标准操作。

三、统计学处理

采用 SPSS 23.0 软件进行统计学分析，计数资料用例数或百分率 ( % ) 表示，正态分布计量资料用±s表示。两组阳性率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般情况描述

30 例临床怀疑骨感染患儿，平均年龄 ( 5.77±4.52 ) 岁。经手术或穿刺无菌采集 41 例病灶处样本，其中经临床诊断、实验室检查或影像学确诊为细菌感染样本 36 例，畸形或其它非细菌感染样本5 例 ( 表 1 )。

二、16S rRNA 基因测序与同期培养阳性率的比较

41 例样本中，16S rRNA 基因测序和同期培养阳性率分别为 69.4% 和 38.9%，具体检出结果见表 1。对两组的结果进行χ2检验，两者阳性率差异有统计学意义 (χ2＝6.769，P＝0.009 )，提示 16S rRNA 基因测序阳性率显著高于传统培养。16S rRNA 基因测序检测不同类型样本阳性率相当 ( 骨组织 / 滑膜等组织阳性率为 68.4%，脓液 70.6% )；培养法检测组织类型样本阳性率则高于脓液样本 ( 47.4%vs.29.4% )，但两者阳性率比较差异无统计学意义 (P＞0.05 )( 表 2 )。

三、儿童骨感染 16S rRNA 基因测序病原菌分析

通过 16S rRNA 基因测序发现，儿童骨感染最常见病原菌为金黄色葡萄球菌 ( 48.0% )，其次为化脓链球菌 ( 28.0% ) ( 表 3 )。

四、16S rRNA 基因测序与传统培养的灵敏度和特异度分析

16S rRNA 基因测序的灵敏度为 69.4%，特异度100.0%，培养的灵敏度为 38.9%，特异度为 100.0%，两者灵敏度比较差异有统计学意义 (P＜0.05 )，而特异度比较差异无统计学意义 (P＞0.05 ) ( 表 4 )。

表 1 临床怀疑骨感染患儿一般情况Tab.1 General description of clinically suspected bone infectious samples

五、16S rRNA 基因测序检测耗时分析

16S rRNA 基因测序包括基因组提取、PCR 扩增、核酸电泳检测、测序分析等过程，阴性结果的平均检测耗时为 7.50 h，阳性结果平均检测耗时24.88 h；传统培养需增菌培养，阴性和阳性结果检测耗时分别为 68.19 h 和 67.50 h。因此，16S rRNA基因测序检测耗时明显少于传统培养法 (P＜0.001 )( 表 5 )。

表 2 16S rRNA 基因测序和同期培养阳性率比较Tab.2 Comparison of the positive rate between 16S rRNA gene sequencing and traditional culture

表 3 儿童骨感染 16S rRNA 基因测序病原菌分析Tab.3 Pathogen analysis of 16S rRNA gene sequencing in bone infection of children

表 4 16S rRNA 基因测序与传统培养的灵敏度和特异度分析Tab.4 Analysis of sensitivity and specificity of 16S rRNA gene sequencing and traditional culture

表 5 16S rRNA 基因测序与传统培养检测耗时比较 (±s，h )Tab.5 Time-consuming comparison between 16S rRNA gene sequencing and traditional culture ( x- ± s, h )

表 5 16S rRNA 基因测序与传统培养检测耗时比较 (±s，h )Tab.5 Time-consuming comparison between 16S rRNA gene sequencing and traditional culture ( x- ± s, h )

检测结果 16S rRNA 基因测序耗时 培养耗时 P 值阴性 7.50±6.43 68.19±32.92 ＜ 0.001阳性 24.88±4.59 67.50±25.49 ＜ 0.001

讨 论

关于骨感染培养的敏感性说法不一，有研究称其灵敏度可达到 50.0%[8]。本研究培养法灵敏度为38.9%，敏感性不高的可能原因是本研究中所有患儿在术前均经验性使用抗菌药物，且 16S rRNA 基因测序在我国并没有完全普及，临床科室可能倾向选择培养阴性样本进行测序，导致样本入组选择存在偏倚，因此，该传统培养敏感性不能完全代表传统培养在骨感染的敏感性。

本研究中，16S rRNA 基因测序灵敏度 ( 69.4% )显著高于传统培养 ( 38.9% )，显示其在儿童骨感染的诊断方面较好的应用前景。Zhorne 等[1]分析近5 年相关文献，骨科感染病原菌谱系主要有金黄色葡萄球菌和链球菌。本研究通过 16S rRNA 基因测序发现，在儿童骨感染中，主要病原菌是革兰阳性球菌 ( 金黄色葡萄球菌 48% 和化脓链球菌 28% )，与其研究结果一致。16S rRNA 基因测序可检出所有传统培养阳性的病原体，并且 16S rRNA 基因测序还可以检测出传统培养阴性的病原体，在临床少见菌、苛养菌以及固体培养基不生长细菌的鉴定中具有独特优势。本研究通过 16S rRNA 基因测序方法在 6 例脓液样本和 1 例滑膜样本中检出化脓链球菌，1 例脓液样本中检出无乳链球菌，1 例滑膜样本中检出流感嗜血杆菌，2 例组织样本中检测到肠道沙门菌，而这 11 例样本经培养均无细菌生长，可能在于这些细菌不适于传统平板培养，或者样本采集过程中细菌已死亡，导致培养假阴性的结果。但本研究局限于例数较少，有待于进一步扩大样本验证基因测序法的优势。本研究还发现脓液样本培养阳性率低于组织类型样本，虽然限于样本例数而没有统计学显著差异，但也提醒儿童骨感染中优先采集组织样本进行培养，而 16S rRNA 基因测序对于两种类型样本检测阳性率相当，说明基因测序法检测病原菌受样本类型影响较小。细菌 16S rRNA 基因测序能够快速准确鉴定细菌及其种类，耗时短 (＜1 天 )、敏感性高、特异性强、受抗生素影响小[9]。

16S rRNA 基因测序也存在明显的不足，例如昂贵的仪器、严苛的无菌实验条件、对于测序公司的依赖等都限制了其在基层医院广泛推广使用。并且 16S rRNA 基因测序对于部分亲缘关系较近的细菌无法区分至属的水平[10]。本研究中，1 例脓液样本传统培养结果为阴沟肠杆菌，与之对应的 16S rRNA基因测序结果为肠杆菌属，原因在于肠杆菌属 16S rRNA 基因序列同源性较高。

传统培养法因其方法简单，且可以进行药敏试验，仍然是骨感染病原菌诊断的“金标准”[11]。而16S rRNA 基因测序较传统培养具有灵敏度高、耗时短等优点，还可以检测出传统培养阴性的病原体，在临床少见菌、苛养菌以及固体培养基不生长细菌的鉴定具有独特优势，对儿童骨感染病原菌的早期诊断具有一定的应用价值，可作为传统培养方法的一个有效补充。