山药皮中总黄酮的超声辅助乙醇提取工艺研究

2019-12-20张金凤柴云雷马丽媛张雅娜

绥化学院学报 2019年12期

张金凤马雪李杨柴云雷马丽媛张雅娜

（绥化学院食品与制药工程学院黑龙江绥化 152061）

山药又称薯蓣、土薯、山薯蓣、怀山药、淮山、白山药，一年或多年生蔓生草本植物。山药根茎肉质洁白，营养丰富，兼食、药为一体[1,44]。除含淀粉、黏液多糖、皂苷、黄酮、色素多酚类物质、植酸、山药碱、8大必须氨基酸等成分外，还含有铁、磷、钙等多种无机元素[2-3]，具有补脾养胃、补肺益肾的功效，可用于治疗脾虚久泻、慢性肠炎、慢性胃炎、肺虚咳喘、糖尿病、遗精和遗尿滞下等症[4]。黄酮是一类以苯色酮环为基础的酚类化合物，多为结晶性固体，溶解度因结构及存在状态不同而有很大差异。黄酮具有抗氧化、改善血液循环、降低胆固醇、抑制炎性生物酶渗出等作用。

目前，提取山药中总黄酮的相关研究较多，孙亚琴[6]利用双水相提取山药总黄酮，研究表明，60℃时用PEG-磷酸氢二钾提取山药总黄酮的效果相对较好。周厚良[7]利用热浸提法提取山药中黄酮进行工艺优化，结果表明体积分数为70%，料液比为1：20，50℃提取120min 时提取率相对较高。徐东生[8]采用微波法提取山药中的黄酮，研究最佳提取条件。但对于作为废料丢弃的山药皮研究的较少，仅赵立庭[9]和刘青[10]分别采用回流和索氏提取进行山药皮中黄酮的提取，然而回流和索氏提取一般耗时间比较长，故从整合资源限度最大利用及生产效率等角度考虑，本文以山药皮为原料采用超声波辅助乙醇提取总黄酮，在提高生产效率的同时提高山药本身经济价值，为其综合利用提供科学依据。

一、材料与方法

（一）材料与设备。山药：绥化市售；芦丁标品：中国药品生物制品鉴定所；亚硝酸钠、无水乙醇、石油醚、硝酸铝和氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。

721型分光光度计，上海元析仪器有限责任公司；电热恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；万能粉碎机，天津市泰斯乐仪器有限公司；数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

（二）实验方法。

1.山药皮中黄酮的提取。称取一定量的山药，洗净，剔皮，放入平面皿在干燥箱中60℃烘干，待冷却，用粉碎机粉碎干燥的山药皮碎片过50目筛。准确称取5g山药皮粉，加入50mL95%乙醇浸泡2h，再用超声波提取30min，抽滤，滤液用等体积的石油醚脱脂，再将滤液再进行浓缩至10mL，放置100mL 容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，得总黄酮样品液[1，44]。

2.芦丁标准曲线制作。分别吸取质量浓度为0.1mg/ml的芦丁标准对照液 0.0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL，3.0mL、4.0mL，5mL置于10ml容量瓶中，分别加入0.3mL亚硝酸钠溶液（5%），充分摇匀，放置6min；再加入0.3mL 硝酸铝溶液（10%），充分摇匀，放置6min，再加入4.0mL 氢氧化钠溶液（4%），用80%乙醇定容至刻度，充分摇匀后，放置12min，以无芦丁対照液所在的容量瓶为空白对照，510nm波长处测其吸光度（A）。以芦丁浓度为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线[11]。

3.样品溶液含量测定。取待测样液1mL放置于10mL容量瓶中，按2中标准曲线配制方法测定吸光度,并通过标准曲线回归方程得出样品液浓度,计算提取率。

式中：C 根据芦丁标准曲线计算样品中黄酮的含量，单位mg；

N为稀释倍数；

V为待测液体积，单位mL；

M为样品山药皮质量，单位g。

4.单因素试验。以总黄酮提取率为指标，分别选取乙醇的体积、超声功率、料液比及超声时间作为单因素，进行试验。从中选取适宜的条件，进行下一步正交试验。

5.响应面法优化工艺条件。根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，在单因素结果的基础上，以乙醇体积分数（A）、超声功率（B）、料液比（C）和超声时间（D）为响应因素编码水平为-1、0、1，山药皮中总黄酮的提取率（Y）为响应值，采用四因素三水平的响应面分析法进行实验设计。设计的因素水平表，如表1所示。

表1 响应面实验因素水平表

二、结果与分析

（一）标准曲线的绘制。根据方法2测定吸光值，绘制标准曲线，见图1。

图1 芦丁标准曲线

（二）乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。称取6 组各5g 干燥山药粉，在超声波功率为300W，料液比为1：50 条件下，分别加入体积分数为40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇浸泡2h，超声处理20min。乙醇体积分数对山药皮中总黄酮提取率影响见图2。

图2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

由图2可知，乙醇体积分数从40%升高到70%山药皮中总黄酮提取率增加，在乙醇体积分数为70%时，总黄酮提取率最大为0.366%，超过70%时，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率急剧下降，可能原因是提取过程中，乙醇浓度加大，提取溶液中低极性杂质在提取溶剂中的含量不断增加，导致溶液粘度增加，同时阻碍了黄酮类化合物的溶出，导致黄酮类物质提取量降低。同时使黄酮稳定性被破坏[8]。所以由图2综合分析考虑，选择乙醇体积分数为70%较佳。

（三）超声波功率对总黄酮提取率的影响。称取6 组各5g干燥山药粉，在乙醇体积分数为70%，料液比为1：50，超声波功率分别为100W，150W，200W，250W，300W，350W 条件下，先将6组样品乙醇浸泡2h，再在超声波处理20min，超声波功率对山药皮中总黄酮提取率影响见图3。

图3 超声波功率对总黄酮提取率的影响

由图3 可以看出，随着超声波功率的增加，总黄酮的提取率也逐渐增加，并在300W 时达到最大，之后出现下降趋势，总黄酮提取率之所以随着超声波功率的增加而提高，是由于当超声波在溶剂中传播时，产生强烈的剪切力，引起了山药组织细微裂缝的形成。超声波功率越大，超声波在提取介质中的振幅越大，剪切破碎越剧烈有效成分的提取率越高。而超声波功率大到一定程度时，黄酮类化合物的结构则会被破坏，因此山药皮中总黄酮提取量不会随着功率增加而抑制持续升高[12]。综合考虑，选择超声波功率300W较好。

（四）料液比对总黄酮提取率的影响。称取5组各1g干燥山药粉，在超声波功率为300W，分别加入10mL，20mL，30mL，40mL，50mL70%乙醇，超声处理20min。液料比对山药皮中总黄酮提取率影响见图4。

图4 液料比对总黄酮提取率的影响

由图4 可以看出，随着液料比的增大，提取率也随之增加。但当达到50：1之后，提取率出现小幅度下降。分析原因可能是，提取溶剂量越大，形成的细胞壁内外浓度差越大，扩散动力增强，山药皮中的有效成分越容易从细胞内渗出，提取率越高。但溶剂用量过大，会导致除黄酮类以外的物质溶出，从而导致提取率降低，并且在实际生产过程中，溶剂用量太大会给后续的浓缩造成困难，使工业生产效率下降。但是，液料比也不能过低，否则会使山药皮中的黄酮类化合物则不能被充分溶出，导致最终提取率将偏低。综合考虑，本研究选择液料比50：1较适宜。

（五）超声时间对总黄酮提取率的影响。称取6组各5g干燥山药粉，在乙醇体积分数为70%，料液比为1：50，超声波功率300W，条件下，先将6组样品乙醇浸泡2h，再在超声波分别处理10min，15min，20min，25min，30min，35min，超声波时间对山药皮中总黄酮提取率影响见图5。

图5 超声波时间对总黄酮提取率的影响

由图5可知超声时间在10-20min时，随着超声时间的延长，总黄酮的提取率在增大，但当超声时间超过20min后提取率出现下降，可能是加上前面2h的浸泡和超声长时间处理导致溶剂乙醇大量挥发的原因，所以超声时间20min为宜。

（六）响应面模型的建立及显著性分析。

1.响应面设计方案。Box-Benhnken 实验设计与结果如表2所示。

表2 Box-Benhnken实验设计和结果

2.方差及显著性检验。用软件Design-Expert.8.0.6进行乙醇体积分数、超声功率、液料比及超声时间四个因素对山药皮中总黄酮提取率影响的回归分析，分析结果见表3所示。对各个因素进行拟合，获得回归方程：总黄酮提取率（%）=+0.40+0.013A-2.917E-003B+3.500E-003C-6.250E-003D-0.015AB-2.500E-003AC-0.028AD+1.250E-003BC+6.750E-003 BD-7.250E-003CD-0.064 A2-0.080B2-0.077C2-0.055D2

表3 回归方程方差分析

注：**差异极显著（p<0.01）;*差异显著（p<0.05）

由表3可见，回归方程方程分析显著性检验表明，该回归模型显著（p<0.0001），失拟项不显著（p=0.1669>0.05），表明该模型具有统计学意义。回归方程中A、B、C、D的平方项p<0.01对响应值的影响极显著；一次项A和交互项AD对响应值的影响显著。各因素影响大小排序为A>D>C>B即乙醇体积分数>超声时间>液料比>超声功率。

3.最佳工艺参数的确定。通过Design-Expert.8.0.6软件对回归方程进行计算，得出超声辅助乙醇提取山药皮中总黄酮的最佳工艺条件，即乙醇体积分数为71.26%，超声功率298.33W，液料比50.24：1，超声时间为24.54，在此条件下，山药皮中总黄酮的提取率理论值为0.4000193%。考虑到在实际中操作的可行性，将各工艺条件修正为：乙醇体积分数为70%，超声功率300W，液料比为50：1，超声时间为25min，在此条件下进行三次重复实验，得总黄酮提取率为0.399%，与理论预测值的相对误差0.25%，再次验证该回归模型具有一定有效性。