抗氧化酶抑制剂对人肝L02细胞自噬的影响

王程 纪朋艳 李庆华 李强 安英 隋春红

(吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013)

1 材料和方法

1.2细胞培养及处理 采用含10%FBS的RPMI1640培养液在37℃、5% CO2环境中培养人肝L02细胞，每2 d按1∶4的比例传代1次。实验时PBS清洗2次，再用2.5 g/L胰酶细胞消化液使细胞悬浮，取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，细胞计数调整细胞密度为1×107个/ml，再根据不同的细胞密度接种于不同孔径培养板中。处理前用不含FBS的RPMI1640培养液培养12 h使细胞同步化，然后随机分为如下5组：(1)对照组：培养液中常规培养；(2)SOD抑制组：培养液中加入DETC；(3)CAT抑制组：培养液中加入ATZ；(4)GPx抑制组：培养液中加入PEN；(5)CAT和GPx联合抑制组：培养液中加入ATZ和PEN。给药剂量分别为2 mmol/L DETC〔7〕，10 mmol/L ATZ〔8〕，0.1 mmol/L PEN〔9〕，继续培养细胞12 h后检测各项指标。

1.4细胞相对活性的测定 将L02细胞按1×104个/孔接种于96孔板上培养，经处理后弃去各组剩余培养液，在每孔加入含5 g/L MTT培养液120 μl，37℃，5% CO2环境中孵育4 h，弃去孔内培养液，每孔加200 μl DMSO，轻度震摇10 min溶解结晶物，用酶标仪在490 nm处测定各孔吸光度值，计算细胞相对活性。

1.5细胞自噬标志蛋白表达的测定 蛋白质印迹法检测LC3、Beclin-1、P62蛋白表达。将L02细胞按1×106个/孔接种于6孔板上培养，经处理后收集细胞，PBS清洗2次，提取细胞总蛋白后考马斯亮蓝法测定蛋白含量。取细胞总蛋白液200 μl，加5×蛋白上样缓冲液50 μl，煮沸10 min。配制15%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔加50 μg蛋白上样，进行SDS-PAGE后电转印到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶1 000稀释的LC3B、Beclin-1、SQSTM1/p62和β-actin一抗，4℃孵育14 h，TBST漂洗后加1∶2 000稀释的HRP-IgG二抗，室温孵育2 h，TBST充分漂洗后加电化学发光试剂显影，用Quantity One软件对蛋白条带进行定量分析。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、Pearson相关性分析。

2 结 果

表1 抗氧化酶抑制剂对L02细胞内产生能力和H2O2、GSH含量的影响

与对照组比较：1)P<0.05；下表同

2.2抑制剂对细胞内抗氧化酶活力的影响 与对照组比较，SOD抑制组细胞内SOD活力显著降低(P<0.05)，CAT抑制组、CAT和GPx联合抑制组细胞内CAT活力显著降低(P<0.05)，GPx抑制组及CAT和GPx联合抑制组细胞内GPx活力显著降低(P<0.05)。见表2。

2.3抑制剂对细胞相对活性的影响 与对照组比较，各组细胞相对活性显著下降(P<0.05)。见表2。

表2 抗氧化酶抑制剂对L02细胞内SOD、CAT和GPx活力及细胞相对活性的影响

2.4抑制剂对细胞自噬标志蛋白LC3、Beclin-1和P62表达的影响 与对照组比较，SOD抑制组及CAT和GPx联合抑制组细胞中Beclin-1和P62的相对表达量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均显著提高(P<0.05)。见表3，图1。

表3 抗氧化酶抑制剂对L02细胞自噬标志蛋白LC3、Beclin-1和P62表达的影响

1～5:对照组、SOD抑制组、CAT抑制组、GPx抑制组、CAT和GPx联合抑制组图1 抗氧化酶抑制剂对L02细胞自噬标志蛋白LC3、Beclin-1和P62表达的影响

表4 各项实验指标的相关性(r值)

1)P<0.05

3 讨 论