国兰优良品种杂交及种子无菌萌发研究

张晓英，饶春荣，郑新妹，傅建炜*

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建福州350003；2.福建连城兰花股份有限公司，福建龙岩366211)

国兰指中国境内兰属(Cymbidium)的地生种类，如春兰(C.goeringii)、蕙兰(C.faberi)、寒兰(C.kanran)、建兰(C.ensifolium)、墨兰(C.sinense)等，在我国有一千余年的栽培历史，全属约48种，分布于亚洲热带与亚热带地区，向南到达新几内亚岛和澳大利亚。我国有29种，广泛分布于秦岭山脉以南地区(吉占和，1999；陈心启等，1998)。

兰花作为中国的传统名花，因其株型典雅、花姿优美、幽香四溢，自古以来深受人们的喜爱，被誉为“花中君子”并赋予各种美好的寓意。兰花种子非常细小、呈粉状，只有在显微镜下才能看清楚其结构。一般国兰种子长1～2 mm，直径为0.1～0.2 mm，重量只有0.3～6.5 μg，呈长纺锤形(田甜等，2009)，数量极多且非常细小，其种皮致密、透性差或种皮含有抑制物(丁秋露等，2010)，种胚经常发育不完全或不成熟，并且没有胚乳(潘银萍，2011)，所以导致国兰种子在自然条件下萌发率非常低。自1922年Kundson将消毒后兰花种子播种于含糖培养基上成功萌发后，兰花组培技术得到不断的开发和完善，为兰花杂交育种和兰花产业发展奠定了坚实的技术基础(刘武等，2008；周辉明等，2010；李风童等，2015)。

本试验选取3种国兰传统品种进行杂交和无菌播种，以前人研究为基础，通过改进培养基配方来选育性状优良的新品种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选取国兰7大类中的春兰、建兰和蕙兰里的传统名种为父母本材料，分别是黄梅(父本)×黄荷(母本)、君荷(父本)×市长红(母本)、315梅(父本)×庆华梅(母本)。

1.2 杂交

2015年2月开始，在花期挑选生长良好的植株进行杂交，采集所选品种的成熟饱满花粉授粉到亲本雌蕊柱上，做好标记。

1.3 组培

无菌播种：在授粉后120～210 d，每隔30 d采收黄梅×黄荷，君荷×市长红，315梅×庆华梅杂交果实进行无菌萌发试验。将采回的果荚用75%酒精消毒1～5 min，视果荚大小而定，然后用1%～2%的次氯酸钠漂白液消毒20～25 min。消毒后用灭菌过的刀片将果荚切开，将果荚里的兰花种子播种到蔗糖含量20 g·L-1的改良的MS培养基上，在暗培养室内进行萌发，观察萌发率。

初代培养：种子成功萌发出原球茎后将其夹出，接种到蔗糖含量20 g·L-1的改良的MS培养基中进行扩繁。原球茎均匀分散在增殖培养基上并与其充分接触。由于原球茎增殖速度较快，因此原球茎之间的摆放不可太紧凑，留0.3～0.5 cm空隙，然后置于恒温室内暗培养，并观察原球茎的增殖情况。

继代培养：将增殖好的原球茎及根状茎(俗称龙根)夹出，在超净台内用刀片将附着在根状茎表面的旧培养基刮净，然后接种到蔗糖含量25 g·L-1和椰子汁含量50 g·L-1的改良的MS培养基中诱导小芽，接种到催芽培养基中时，应将生长大小较一致的根状茎放在一起。

成苗培养：起芽后随时观察小芽的生长情况，待其生长至7～10 cm时即可进行生根定植。

生根培养：将成功诱导出的国兰小芽切下，不可弄伤假鳞茎和小芽，切下后接种到生根培养基中进行定植生根。定植时需将小芽的假鳞茎压至培养基内2/3处左右，如小芽已有生根，尽量保留其根部定植于培养基中。生根定植后期适当添加光照，防止炼苗时小苗叶片起斑点。待小苗生根成功后将其转移到炼苗室内进行炼苗、壮苗。炼苗要适当遮光，不可阳光直射，避免小苗焦尖等。

出瓶移栽：将炼好的小苗掏出，并用清水将根部的培养基洗净，避免根部发霉死苗。洗干净的小苗晾干后种植于大棚内。前期需做好水分的调控，防止焦尖。

2 结果与分析

2.1 杂交种子萌发

由各组萌发情况(表1)可知，种子的萌发情况与种子的成熟度密切相关，不同成熟度的果实，对种子的萌发影响较大。授粉后150～180 d的种子，播种后种子萌发率达60%以上，萌发效果较好，因此，采收时期以150～180 d为佳。

表1 不同采收时期播种萌发情况Table 1 Germination of various seeds obtained at different harvesting stages

2.2 培养基

本试验使用的是改良的MS培养基。在种子无菌萌发和初代培养的培养基中加入蔗糖(20 g·L-1)，在继代培养的培养基中加入蔗糖(25 g·L-1)和椰汁(50 g·L-1)，种子能正常萌发，不定芽形成且生长健壮，并成功获得了生长健壮的杂交后代完整植株(图1，表2)；3个组合杂交后代均获得小苗种植于大棚内(图2)。

图1 不同杂交组合后代在改良MS培养基的生长情况Figure 1 Growth of progenies of different hybrid combinations on improved MS medium

表2 不同杂交组合后代生长情况Table 2 Growth of progenies of different hybrid combinations

图2 杂交后代的幼苗生长情况Figure 2 The seedlings of hybrid offspring

图1 (a)、图2(a)黄梅×黄荷杂交后代小苗，叶尖圆钝，叶姿中垂型。图1(b)、图2(b)君荷×市长红杂交后代芽点与其母本市长红新芽一样，均带有粉红色。图1(c)、图2(c)为315梅×庆华梅杂交后代苗芽，与母本相似，其叶脉清晰可见。

3 讨论与结论

兰属的种子萌发难，其原因可能是由于胚发育不全或无胚乳，也可能是由于种皮较厚、结构致密，阻碍了空气和水的透入，还有可能存在抑制萌发的物质(祝鹏芳等，1997)。相关资料显示，一般用半成熟的种子进行培养萌发，这可能是因为兰花种子里的抑制物质随着种子成熟逐渐形成并加强，且未成熟种子更容易灭菌(陈光禄，1983)。徐晓薇等(2011)研究了果龄对寒兰杂交种子萌发的影响，发现杂交授粉后180～240 d为寒兰种子的最佳采收时间，早于180 d，种子萌发欠佳，晚于240 d，种子萌发率显著下降。以上研究均表明，兰花种子在不同发育阶段存在不同的萌发特性。本试验对春兰(黄梅×黄荷)、建兰(君荷×市长红)、蕙兰(315梅×庆华梅)不同时期采摘的果荚在无菌萌发过程中的萌发情况进行观察，结果表明，种子的萌发数量与种子的成熟度密切相关。授粉后150～180 d的种子，播种后可获得理想的无菌萌发效果，种子萌发率达60%以上。因此，采收时期以150～180 d为佳。

兰属组织培养的培养基种类较多，无菌播种最常用的基本培养基有：MS、I/2SH、VW、White等 (李方等，1998；张志胜等，2001；陈菁瑛等，2004；范成明等，2003)。 原球茎诱导增殖的培养基，常用的是改良的 Knudson C、MS、Kyoto、White、VW(张菊野等，1993；王熊，1990)。曾宋君等(1998)对墨兰无菌萌发研究发现，在以10%椰子汁、香蕉汁、苹果汁、绿豆汁作添加物时，椰子汁对胚萌发的促进作用最大；活性炭对胚萌发的促进作用不明显。郑琪等(2007)认为，活性炭能提高杂交春兰种子的萌发率。朱国兵(2006)在寒兰的无菌萌发研究中也发现活性炭对寒兰种子萌发有促进作用。本试验在种子无菌萌发和初代培养改良的MS培养基中加入蔗糖(20 g·L-1)，在继代培养改良的培养基中加入蔗糖(25 g·L-1)和椰汁(50ml g·L-1)，春兰(黄梅×黄荷)、建兰(君荷×市长红)、蕙兰(315梅×庆华梅)杂交的F1代种子在改良的MS培养基上能正常萌发，并成功获得生长健壮的杂交后代完整植株，为进一步筛选株型适中且抗逆性强的新种质提供了基础，对今后开展兰属杂交育种以及优良株系的快速繁殖提供了参考。