载药脂肪乳的质量控制进展

文/董武军 叶军 通讯作者/吴朝阳

脂 肪 乳（lipid/fate mulsion）是以植物来源为主的液态甘油三酯为油相，磷脂为主要表面活性剂，在高压均质等外力作用下乳化制成的水包油乳状液，通常平均粒径为100～500 nm，其粒径大小、结构与体内乳糜微粒类似。脂肪乳始于1961年在瑞典成功上市的肠外营养型脂肪乳注射液Intralipid®，作为一种安全的机体能量和必需脂肪酸补充剂，营养脂肪乳现已广泛应用于临床[1]。随着临床的应用需要和药物递送技术研究的深入，脂肪乳现已成为难溶性药物递送的一种优良载体，其具有独特的优点：将药物包载在油相中，可提高药物的溶解度和稳定性；同时由于包载效应，可以明显降低药物刺激性和不良反应；以精制植物油和卵磷脂为主要载体材料的营养脂肪乳注射液已有多年临床应用历史，安全性风险低；能够耐高压灭菌且易于工业化大生产等[2]。

然而，脂肪乳作为一种热力学不稳定的乳状分散体系，其处方和制备工艺等因素均有可能影响其质量，尤其是稳定性，可能发生聚集或絮凝（flocculation）、分层（creaming）和合并（coalescence），最终导致破乳（demulsification，油水相分离），载药后药物往往会影响油水界面膜结构和特性，导致稳定性发生变化，同时脂肪乳还存在包封率不高等问题。这给载药脂肪乳处方工艺研究增加了难度，也为质量控制带来了巨大挑战。本文汇总国内外载药脂肪乳产品上市情况和质量控制现状，并针对其载体特性，介绍了载药脂肪乳关键质量指标评价技术和方法，为载药脂肪乳质量研究和控制提供一定的参考。

1.概述

1.1 载药脂肪乳发展概况

脂肪乳作为药物递送载体，以其优良的性能、良好的安全性和比较成熟的制备工艺受到广泛关注。国内外已有多种载药脂肪乳制剂上市（表1），临床上主要应用于麻醉、心血管病治疗、抗肿瘤等；其中非传统载药脂肪乳——环孢素眼用乳剂和二氟泼尼酯眼用乳剂以蓖麻油和聚山梨酯80为主要载体材料，其他治疗型脂肪乳商品制剂多以经典营养型脂肪乳注射液Intralipid®的处方和工艺为基础。近年来，国内外在提高脂肪乳载药量和稳定性，延长其体内循环以及增强靶向性等研究不断深入，同时不再主要局限于注射途径给药，在口服，眼、鼻腔及肺部给药也有广泛研究[2-4]。

1.2 载药脂肪乳质量控制要求

1.2.1 国内外药典质量控制情况

《中国药典》2015年版（ChP2015）制剂通则规定了口服乳剂的离心稳定性（约1800 r/min离心15分钟）和相分离再分散的特定要求；规定了乳状型注射液不得有相分离现象和乳滴粒径分布要求。《美国药典》42版（USP42）制剂通则中规定了用于静脉给药的脂肪乳一般性检查项和粒度特定检查项；脂肪乳注射液（lipid injectable emulsion）通则规定了脂肪酸组成、细菌内毒素、pH、粒度、游离脂肪酸以及包装和贮藏、标签等一般性要求；USP<729>Globule size distribution in lipid injectable emulsions规定了脂肪乳注射液平均粒径和5μm以上大粒子的测定方法和限度要求。国内外主要药典收载的载药脂肪乳品种较少，仅收载了丙泊酚脂肪乳注射液[ChP2015第一增补本、USP42、《英国药典》2019年版（BP2019）]和前列地尔脂肪乳注射液[《日本药典》17版（JP17）]，相关考察项目汇总见表2。

表1 部分国内外上市载药脂肪乳品种

1.2.2 国内外载药脂肪乳相关指导原则

国内还没有载药脂肪乳的特定指导原则，仅在ChP2015《9014微粒制剂指导原则》提出了残留溶剂、形态、粒径及其分布、载药量、包封率、突释效应或渗漏率、氧化程度等微粒制剂应检查项目的原则性要求。美国食品药品管理局（FDA）分别于2016年6月、10月和2017年2月发布了丙泊酚脂肪乳注射液、环孢素眼用乳剂和二氟泼尼酯眼用乳剂的研究指导原则草案，阐明了推荐的体外研究和体内研究两种证明生物等效的研究方法。体外研究首先要求仿制制剂处方组成（Q1）和辅料用量（Q2，差异在5%以内）与参比制剂相同，需要对粒径及其分布、动力黏度特征、pH值、Zeta电位、渗透压、游离酸、药物相分布等理化特性进行研究和相似性比较，并采用基于乳滴粒径及其分布（中位径D50和径距（SPAN）或强度权重平均粒径和多分散系数）的体外群体生物等效 性（population bioequivalence，PBE）方法或采用针对粒度呈现复杂多峰分布的earth mover' s distance（EMD）等统计学方法比较粒度的相似性。还要求采用对生产工艺变化有区分力的释放方法进行体外释放的比较研究。另外，丙泊酚脂肪乳注射液还要求考察仿制制剂与5%葡萄糖注射液配伍的稳定性，以及与参比制剂比较在乳酸林格注射液、5%葡萄糖0.45%氯化钠注射液中的相容性。如果与参比制剂辅料不同或者体外特性不具有可比性，仿制制剂应进行体内生物等效性研究。

表2 药典收载的载药脂肪乳质量控制相关项目汇总

随着丙泊酚脂肪乳注射液（丙泊酚乳状注射液）新增订入ChP2015第一增补本，国内在营养型脂肪乳质量控制基础上对载药脂肪乳尤其脂肪乳注射液的质量要求逐渐明确和完善，特别是对过氧化值、甲氧基苯胺值、溶血磷脂、大于5μm乳粒等通用安全性指标的控制日益加强，但针对体现脂肪乳载体特性的质量指标的理解和关注还不够。

2.载药脂肪乳载体特性关键质量控制指标

2.1 粒度

2.1.1 平均粒径及粒径分布

脂肪乳属亚微乳分散系统，粒径及其分布与其有效性、安全性密切相关，也是影响乳剂稳定性的关键因素。乳滴粒径越小、分布越窄，越有利于乳剂的稳定。ChP2015规定丙泊酚脂肪乳注射液的乳粒体积平均粒径或光强平均粒径应小于0.5μm，注射剂通则还规定静脉用乳状型注射液中90%的乳滴粒径应在1μm以下；USP<729>同样规定静脉注射用脂肪乳平均粒径应小于500 nm。通常采用经典光散射法或动态光散 射 法（dynamic light scattering，DLS；也称光子相关光谱法photon correlation spectroscopy）测定脂肪乳平均粒径及粒径分布，还有电子显微镜法、纳米颗粒跟踪分析技术（nanoparticle tracking analysis）、二维扩散排序核磁共振法（2D DOSY-NMR）等用于脂肪乳粒度的测定[5]。经典散射光法建立在散射光的能量分布与颗粒大小密切相关的基础上，依据米氏散射理论和弗朗霍夫近似理论通过迭代反演运算计算出颗粒的粒度，粒径测定范围可达0.01～3500μm，通常采用体积平均粒径D[4，3]或中位径D50，用D10、D90结合 D50或者径距（SPAN）表示粒径分布特征；而动态光散射法是基于布朗运动，通过精确测量粒子散射光强度随时间起伏的变化获得有效扩散系数再由Stokes-Einstein方程得到样品颗粒大小，由于其测量依赖于粒子布朗运动，仅适用于10μm以下颗粒粒径的测量，通常采用光强平均粒径或Z均粒径，用多分散系数（PI）、方差等表示粒径分布特征[6]。

粒度结果与测定原理和计算软件相关，还与仪器参数和样品处理等密切有关，因此需要采用标准粒子对仪器进行评价，优化光学参数、样品稀释倍数等，并对系统适用性、精密度和耐用性等进行验证。通常采用由实际测量结果与理论值的拟合残差或误差、重复性等作为优化指标。陈华等[7]对丙泊酚脂肪乳粒径测定方法及仪器参数的设置进行了初步研究，结果发现经典散射光法的遮光度、吸收率和折射率等光学参数均对粒径有明显影响，因此在脂肪乳粒径研究和评价时要注意粒度分析仪器的参数，不同粒度数据的可比性；同时发现不同原理的设备测定结果存在差异，可能要设置不同的粒度限度，质量标准制定的时候要明确乳滴粒径的测定方法。另有研究发现Nicomp曲线分布分析模型比Gaussian曲线分布能有效表征复杂的粒径多峰分布，更适合脂肪乳处方、工艺的优化和评估[8]。

2.1.2 大于5μm的大粒子

脂肪乳乳滴的粒径大多数在500 nm以下，但由于受处方组成、制备工艺或贮存条件的影响，极易产生大乳滴。研究表明，5μm以上的乳滴与脂肪乳的稳定性、安全性密切相关，同时也反映了脂肪乳研发和制备水平[9，10]。为此，国内外药典除对脂肪乳注射液的平均粒径进行规定外，还对其5μm以上的尾部大粒子进行了严格控制。2004年USP<729>就推荐采用基于单粒子光学传感技术的光阻法或消光法（LE/SPOS法）控制大粒子，规定PFAT5（the volume-weighted percentage of fat greater than 5μm）不超过0.05%。ChP2010采用显微镜法检测，规定大于5μm的乳滴不得检出；ChP2015丙泊酚脂肪乳注射液和脂肪乳注射 液（C14～24）参 照 USP采 用LE/SPOS法，测定5μm以上的大粒子，并规定大于5μm的乳粒加权总体积不得过油相体积的0.05%。

显微镜法直观，不受样品中气泡等影响，但因视野有限和人工观察，难以有效捕捉大乳滴，且易受人为因素影响，不能准确客观反映脂肪乳中大粒子水平。经典光散射法和动态光散射法对于脂肪乳中比例极少的5μm以上的乳滴，响应灵敏度低，不能用于大粒子控制。库尔特计数法、普通光阻法等方法，由于测定时加入电解质，可能会导致乳滴聚集或破裂和（或）不能逐个检测粒子而造成假象，同样也不适合用于脂肪乳的大粒子控制。LE/SPOS法的检测信号来自对单个粒子的快速检测，能有效避免粒子重叠产生的误差和假象，同时对脂肪乳中绝大部分（体积比＞99.9%）粒径小于1.0μm的乳滴不响应，对大乳滴检测灵敏高、分辨率好、专属性强[11]。

2.2 包封率和相分布

2.2.1 包封率

脂肪乳中包封的药物与游离药物存在不同的体内外特征，因此包封率是评价脂肪乳处方、工艺和质量的重要指标，也是其能否发挥高效、低毒等递送特性的关键。脂肪乳与其他微粒制剂一样通常先采用适当的方法将游离的药物与含药乳滴分离，再测定药物量计算得到包封率。常用的分离方法包括透析法、离心超滤法、超速离心法、葡聚糖凝胶柱法、微柱离心法等[12]，见表3；另外，还有微渗析法、离子交换树脂法等用于脂肪乳包封率测定的研究报道[13]。

将游离的药物与包封的药物完全分离并准确定量是包封率测定的关键，因此在建立和验证包封率方法时应重点关注分离情况及其回收率，可选择大豆油、磷脂等载体辅料作为辅助监测指标或采用不同包封状态的脂肪乳等对洗脱或分离程度进行验证。宫晓菲等[14]通过考察洗脱过程中紫杉醇结合脂肪乳中大豆油的含量，并绘制药物不完全包封的载药脂肪乳洗脱曲线，发现微柱离心法可有效分离脂肪乳中游离的药物与包封的药物且柱回收率良好，可准确用于紫杉醇脂肪乳包封率的测定。另外，由于脂肪乳中包封的药物通常脂溶性较好而水溶性较差，在脂肪乳制备或者包封率测定的分离过程中可能出现药物沉淀析出或漂浮在表面，应注意取样的合理性和分离方法的选择，并关注包封率方法的区分力。

表3 常用载药脂肪乳包封率测定分离方法

2.2.2 相分布

脂肪乳分散体系中存在水相、油相和油水磷脂界面层，甚至过量的磷脂等乳化剂在水相中还能形成胶束或类脂质体结构。因此相分布较包封率更能可靠、客观地评价脂肪乳的载药性能，也更能准确地预测和分析脂肪乳的体内外行为。药物理化性质、制备方法、油相及乳化剂等都会对相分布产生影响。药物的表观油水分配系数越大，脂溶性越高，越有利于药物在油相分布，水溶性和亲脂性均不好或者经磷脂复合超分子等技术增溶的药物大多分布在油水界面磷脂层[15，16]。

常采用低温高速离心法测定载药脂肪乳中药物相分布，目前还有微渗析法、荧光标记-共聚焦显微镜法等报道[17]。林翠翠[18]利用低温超速离心法结合超滤离心法对尼莫地平脂肪乳中药物的相分布进行研究，结果发现仅约0.47%的药物游离在水相中，约14.91%的药物分布于胶束/类脂质体结构中，约34.03%的药物分布于油相中，约50.59%的药物分布于脂肪乳的油水界面层中。进一步采用核磁共振技术，发现二氢吡啶类药物载入后脂肪乳油水界面层卵磷脂分子排列发生了改变，影响脂肪乳的稳定性，且药物对微观结构的影响程度与其结构和理化性质有关。

2.3 体外释放

体外释放是载药脂肪乳生产和质量控制的重要指标和手段，也是制剂处方中辅料种类规格或用量、生产工艺等变更前后以及仿制制剂产品质量的一致性评估的需要，FDA个药指南草案要求丙泊酚脂肪乳注射液、环孢素眼用乳剂和二氟泼尼酯眼用乳剂进行体外释放的对比研究。

载药脂肪乳具有粒径分布范围较宽、药物相分布复杂性、乳滴可变形性等特殊性质，存在游离药物分离不准确、载体结构易被破环以及体内行为复杂性等问题，这给其体外释放特征评价带来了一定的难度。目前，载药脂肪乳体外释放特征研究的方法有透析法、反透析法、扩散池法、流通池法等[16，19，20]。载药脂肪乳体外释放方法首要应考虑对制剂质量变化具有合适的区分能力，可通过采用改变处方、工艺的关键因素设计制备得到粒径、包封率等制剂特性不同的一系列制剂，再对其体外释放行为是否存在差异进行验证。理想的体外释放方法还应能较好预测药物在体内的行为，开发有体内预测力的释放方法，需要科学合理地模拟体内环境，可通过在释放介质中加入与亲脂性药物有较强亲和性的白蛋白等体内蛋白增溶、加入脂解酶或利用体外脂解模型、采用能较好模拟乳剂在体内分散状态的反透析法和流通池法等，并结合药物性质、释放机制和体内行为等研究，分析和建立体内外相关性[21，22]。

2.4 物理稳定性

脂肪乳是热力学不稳定体系，加上液态油相与水相之间存在密度差，易发生絮凝、分层、合并和破乳等物理不稳定现象，同时处方、工艺、包装材料、贮藏和临床配伍等也均会影响到脂肪乳物理稳定性，因此物理稳定性是脂肪乳研究的关键难题，也是质量研究和控制的重要关注点[23]。ChP2015规定了口服乳剂离心稳定性以及稳定性期间应对分层现象进行考察，要求乳状型注射液不得有相分离现象，但未明确规定乳剂的物理稳定性快速、准确或量化的评价方法。

脂肪乳物理稳定性评价的常用方法有目测法、粒度法、离心稳定性常数法、计算预测法和加速法等，但这些传统方法存在易受人为主观因素影响、重复性差以及缺乏相关性等问题，也不能真实反映并对稳定性做出准确判断。近年来，多重光散射技术（multiple light scattering，包括静态多重光散射技术和扩散波谱技术）、核磁共振技术、近红外光谱技术、超声频谱分析技术（ultrasonic spectroscopy）等逐步应用于乳剂稳定性的理论研究和评价，这些新技术能快速、较可靠地测定稳定性，并能探究乳状液的稳定或不稳定机制；其中，基于静态多重光散射技术的Turbiscan稳定分析仪可直接快速分析并实时动态监测乳剂等多相体系的稳定性，同时通过对乳滴迁移速度、粒径变化和分层厚度等进行观察，能准确定量比较样品的稳定性，并分析不稳定的机制[24-26]。

3.结语

脂肪乳作为一种药物递送载体，不仅能解决难溶性药物给药问题，还能降低药物不良反应，提高临床疗效；与脂质体等纳米制剂相比，具有更好的安全性和更成熟的生产工艺。在过去的十几年，载药脂肪乳尤其注射途径用脂肪乳高速发展，国内载药脂肪乳质量标准也不断提高，关键辅料甘油三脂和磷脂的质量控制等相关研究也日渐深入[27-30]，但质量研究和控制还有待完善，很多脂肪乳的载体特性关键指标并没有体现在产品的质量标准中，对关键质量属性理解和认识还不够。因此，需要更透彻地对脂肪乳结构、药物相分布等微观和分子水平的研究及理论进行分析，开展理化性质、关键性辅料质量特性与体内生物学特征的相关性研究，促进对关键质量属性的全面和深入的认知，建立合理规范的关键质量指标的限度要求，进而构建全面多维度的科学的质量控制体系。