山西谷子核心资源群体结构及主要农艺性状关联分析

2019-12-19王海岗温琪汾穆志新乔治军

中国农业科学 2019年22期

王海岗，温琪汾，穆志新，乔治军

王海岗，温琪汾，穆志新，乔治军

（山西省农业科学院农作物品种资源研究所/农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，太原 030031）

【】分析山西谷子地方品种遗传多样性和群体遗传结构，筛选与谷子农艺性状相关联的分子标记，为谷子杂交组合亲本选配及分子标记辅助育种提供依据。利用96对SSR标记对595份山西谷子核心资源进行全基因组扫描，采用PowerMarker 3.25软件分析群体遗传多样性，利用STRUCTURE 2.3.4软件分析群体遗传结构，使用TASSEL 2.1软件中GLM（general linear model，Q）和MLM（mixed linear model，Q+K）2种方法，进行表型和标记关联分析。96对SSR引物共扩增出828个等位变异，平均每对引物扩增到8.6个，变化范围为2—26；基因多样性指数变化范围为0.005—0.941，平均为0.610；多态信息量变化范围为0.005—0.938，平均为0.577；各位点杂合度变化范围为0—0.050，平均位点杂合度仅为0.016。群体结构分析将595份核心资源分为3个亚群。4 560个SSR位点成对组合中，共线性组合和非共线性组合之间都存在一定的连锁不平衡。统计概率（<0.01）支持的LD成对位点1 955个，占全部位点组合的42.9%，平均值为0.23。通过GLM方法共检测到12个极显著性位点（＜0.01），表型变异解释率为2.34%—13.94%，平均为6.33%，贡献率较高的等位变异位点是CAAS2050（2=13.94%）和B153（2=11.36%）；通过MLM方法共检测到9个极显著性位点（＜0.01），表型变异解释率为2.80%—9.22%，平均为5.16%，贡献率较高的等位变异位点是P89（2=9.22%）和P3*（2=8.28%）；2种方法共同检测到的极显著性位点有7个。利用SSR标记分析了595份山西谷子核心资源的遗传多样性和群体遗传结构。2种关联分析模型中，GLM方法关联到12个标记与节数、株高、颈长、茎粗、穗长、穗粗、码数、码粒数、蛋白质含量9个性状相关；MLM方法关联到9个标记与节数、颈长、叶宽、茎粗、穗粗、码数、码粒数、千粒重8个性状相关。

谷子；山西；地方品种；SSR；遗传多样性；连锁不平衡；关联分析

0 引言

【研究意义】谷子（（L.）Beauv.）是起源于中国黄河流域的粮饲兼用作物，又称粟，去壳后为小米，在中国的栽培历史可追溯到11 500年前[1]，是世界范围内最古老的禾谷类作物之一。山西谷子种质资源丰富，占全国谷子种质资源的1/5[2]，山西传统的名优谷子品种较多，如东方亮、沁州黄、晋谷21号、晋谷10号，这些品种蕴藏着丰富的优异基因资源。优异基因发掘是作物种质资源研究的重要部分，对作物分子育种具有重要的实践意义。关联分析是基因发掘的有效途径之一，以连锁不平衡为基础，通过对自然群体表型数据和基因型数据的统计检测，寻找性状可遗传变异和标记多态性之间的关联[3-5]。【前人研究进展】目前，关联分析已在水稻库源相关性状[6]、纹枯病抗性[7]等；小麦株高[8]、旗叶叶绿素[9]、穗发芽抗性[10]等性状；大豆农艺性状[9]、加工和品质性状[12-14]、幼苗期耐淹性[15]及棉花农艺和纤维品质性状[16]、叶绿素含量[17]、适宜机采相关性状[18]等已进行了大量研究。且在大麦[19-21]、谷子[22-25]、小豆[28]、豇豆[29]等小宗作物也进行了一定研究。山西谷子年播种面积在22.46×104hm2左右，占全国的1/4[30]，但是作为山西传统杂粮作物的谷子分子辅助育种相对缓慢，充分挖掘山西本土谷子资源中的优良等位变异，利用分子标记辅助选择，创制谷子新种质是谷子资源研究急需开展的工作。【本研究切入点】本研究中所用材料主要来自20世纪50—80年代征集的山西谷子地方品种[31-32]，这些材料未经过育种的选择压力，多数资源是通过自然选择或突变后筛选而保留下来的种质，是环境和历史的载体材料。传统育种主要根据作物的表型和产量性状进行杂交亲本组合配制，对遗传组成的差异考虑较少，导致亲本来源单一，育成品种间遗传基础狭窄，很难培育出具有突破性的优良品种。【拟解决的关键问题】本研究对595份山西谷子地方品种初选核心资源进行遗传多样性分析，明确山西谷子地方品种的遗传结构，寻找与农艺性状显著相关联的分子标记，为谷子种质创新中的优异等位变异发掘、亲本组配和标记辅助选择等提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及表型鉴定

所用595份山西谷子地方品种来源于5 627份山西谷子资源构建的初选核心资源[30]及近年新收集的谷子资源。2017—2018年在山西省农业科学院东阳试验基地种植，对抽穗期、节数、株高、颈长、叶长、叶宽、穗长、穗粗、茎粗、单穗重、穗粒重、码数、码粒数、千粒重、蛋白质含量等15个性状进行鉴定。

1.2 基因组DNA提取

谷子抽穗后取倒二叶，液氮速冻，-80℃保存备用。采用植物基因组DNA提取试剂盒（DP305-03）提取DNA，利用全功能酶标仪（美国伯腾SynergyH1）测定DNA浓度，-20℃保存备用。

1.3 SSR分析

选取分布于9条染色体上的96对引物进行多态性扫描（表1）[22-27]。SSR反应体系包括模板DNA 1.0 μL、2×Tap PCR Mastermix 5.0 μL、10 mmol·L-1Forward primer 0.4 μL、10 mmol·L-1Reverse primer 0.4 μL和ddH2O 3.2 μL。PCR反应程序为95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃（不同引物退火温度根据温度梯度试验确定）30 s，72℃ 60 s，32个循环；72℃ 10 min；4℃保存。扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。

1.4 数据分析

根据SSR扩增产物的电泳结果，参照DNA Ladder记录扩增产物条带的分子量大小。使用Powermarker 3.25软件计算每个位点等位基因数、基因型数、基因多样性指数、多态性信息含量指数和杂合度，并计算Nei遗传距离采用MEGA 5.0软件构建NJ聚类图。

采用Structure2.3.4软件分析群体遗传结构，K取值为1—10，3次重复；将MCMC（markov chain monto carlo）开始时的不作数迭代设为100 000次，再将不作数迭代后的MCMC设为100 000次，其余参数采用软件默认的设置。根据lnP(D)计算ΔK，并依据ΔK值选择一个合适的K值。使用Tassel 2.1软件计算SSR位点组合间的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）水平及支持概率，绘制LD配对检测矩阵图，使用一般线性模型（general linear model，GLM）和混合线性模型（mixed liner model，MLM）结合基因型数据、表型值和Q值，对SSR标记与表型性状进行关联分析，计算<0.01时标记位点对表型变异的贡献率（2）。采用STRUCTURE软件计算Q值，用软件SPAGeDi1.5软件计算Kinship值。

2 结果

2.1 SSR多样性

96对SSR引物在595份山西谷子地方品种核心资源中共检测到828个等位变异，变化范围2—26个，平均为8.6个，其中，标记B109检测到的等位变异最多为26个（表1）。基因型数变化范围在2—47，平均每个位点为13。基因多样性指数变化范围为0.0050—0.9411，平均为0.6097；多态信息量变化范围为0.0050—0.9379，平均为0.5773；各位点杂合度变化范围为0—0.050，平均位点杂合度仅为0.0159，说明谷子异交率很小接近于纯系。每条染色体上标记平均数有10对，平均等位变异为92个；第3和第8染色体检测到等位变异最多，均为107个，第7染色体最少为79个。第3染色体基因多样性指数和多态性信息含量最高，分别为0.720和0.6912，第7染色体最低，分为0.5322和0.4940。第7染色体杂合度最小，为0.0114，第1染色体杂合度最大，为0.0212。

表1 96对SSR引物遗传多样性

续表1 Continued table 1

2.2 群体结构分析

采用Structure 2.3.4软件对595份山西谷子核心资源进行群体遗传结构分析，计算每份材料的Q值（每份种质被分配到对应亚群中的概率）。随着K值的增大，LnP(D)递增，未出现拐点，因此无法准确判断K值（图1）。参照EVANNO等[33]方法，当K=3时，ΔK出现最大值，因此该群体材料被划分为3个亚群（图2）。按照亚群中个体的概率≥0.6时，个体被分配到相应聚类的亚群；亚群中个体的概率≤0.6时，个体被分配到一个混合类群的分配原则，分析每份核心资源对应的Q值。结果表明，595份材料归属为3个亚群，分别包含77、222和187份材料，3个亚群各占比例为12.9%、37.3%和31.4%；另有109份材料在任意一个亚群内Q值均＜0.6，单独划为一个混合群，占比例为18.3%。

基于SSR遗传距离的11个地市聚类分析可以看出（图3），运城、晋城、临汾、长治、阳泉聚为第一类；大同、朔州、忻州、太原聚为第二类；晋中、吕梁聚为第3类。划分的3个类群按照纬度高低自北向南依次分开，这与山西复杂多样的地理生态类型有一定关系，说明山西谷子种质资源存在地理生态型的分化。

A：ln P(D)值与K值的变化图；B：ΔK值随K值的变化图 A: Line chart of K and ln P(D); B: magnitude of ΔK as a function of K

图2 595份山西谷子地方品种的群体遗传结构

2.3 连锁不平衡分析

关联分析以不同位点等位基因间的连锁不平衡为基础，描述群体的重组史。对分布于谷子全基因组96对SSR标记进行连锁不平衡分析，4 560个SSR位点成对组合中，共线性组合（同一染色体）和非共线性组合（不同染色体）之间都存在一定的连锁不平衡（图4）。统计概率（<0.01）支持的LD成对位点1 955个，占全部位点组合的42.9%，平均值为0.23。LD成对位点的值范围主要集中在0—0.2和0.2—0.4（表2），在第2和第4染色体上未发现在0.5以上的LD位点，说明这两条染色体较其他7条染色体受到的选择压力小；分析共线性位点组合的LD，发现第4、第6和第9染色体上的LD成对位点分别有31、35和36个，高于其他染色体，且第6染色体上平均值最高为0.28，说明群体材料中，该染色体上发生重组选择要大于其他染色体。

2.4 SSR标记与性状关联分析

采用Tassel 2.1软件分析了595份山西谷子核心资源在一点2年2种模型的15个性状表型和基因型，结果显示，在<0.01下，共检测到14个SSR标记与11个性状相关联（表3）。GLM方法检测到12个标记与节数、株高、颈长、茎粗、穗长、穗粗、码数、码粒数和蛋白质9个性状相关联。表型变异解释率为2.34%—13.94%，平均值为6.33%。表型变异解释率较大的标记是CAAS2050和B153，解释率分别为13.94%和11.36%；MLM方法检测到9个标记与节数、颈长、叶宽、茎粗、穗粗、码数、码粒数和千粒重8个性状相关联。表型变异解释率为2.80%—9.22%，平均为5.16%。贡献率较高的位点是P89和P3*，解释率分别为9.22%和8.28%。比较GLM和MLM结果，CAAS6023、P3*、In6-2、CAAS2050和B117 5个标记在2种模型条件下同时被检测到。B153、P58、B117、In6-2、CAAS6023和B142标记同时与2个或多个性状相关联，这可能与性状相关有一定关系，说明控制该性状的等位基因可能连锁或一因多效。

与茎粗相关的标记有5个，表型变异解释率为4.45%—9.77%，平均值为6.72%，贡献率最高的位点为P89；与码数相关的标记有4个，表型变异解释率为2.58%—13.94%，平均值为5.76%，贡献率最高的位点为CAAS2050；与蛋白质相关的位点有3个，表型变异解释率为4.25%—11.36%，平均值为8.61%，贡献率最高的位点为B153；与节数相关的位点有2个，表型变异解释率为5.20%—5.97%，平均值为5.63%，贡献率最高的位点为P58；与穗长相关的位点有2个，表型变异解释率为2.34%—6.05%，平均值为4.16%，贡献率最高的位点为B153；与穗粗相关的位点有2个，表型变异解释率为4.57%—6.46%，平均值为5.94%，贡献率最高的位点为B142。

表2 不同D'值范围LD成对位点数

图4 9条染色体SSR位点的连锁不平衡分布

3 讨论

3.1 山西谷子资源的遗传多样性

优异基因发掘是种质资源高效利用和作物遗传改良的基础，种质资源的遗传多样性评价和群体遗传结构的分析是优异基因发掘的前提条件。关联分析将蕴藏在不同种质中的等位变异与表型性状建立了联系，通过寻找显著关联位点，可以发掘种质资源中优异等位基因。山西谷子资源丰富，栽培历史悠久，名优品种众多，但是传统谷子育种只是简单的品种杂交，通过应用分子标记辅助选择聚合有利基因，改良谷子地方品种，是山西谷子育种和种质创制的新途径。本研究采用SSR标记对山西谷子地方品种核心资源进行遗传多样性评价，分析群体遗传结构，挖掘与农艺性状关联的分子标记，对指导山西谷子资源的利用和育种亲本选择具有指导意义。

通过对595份山西谷子核心资源进行分子标记扫描，发现平均等位基因8.6个，平均基因多样性指数0.610，平均PIC为0.577，低于Wang等[22]和Jia等[23]对全国谷子地方品种和育成品种研究结果，同时也低于Vetriventhan等[24]的研究，说明山西谷子资源的遗传多样性要低于全国和世界的谷子资源。但与GUPTA等[25]和Jia等[34]研究结果相近，这与等位变异统计方法和试验选择引物有一定关系。山西行政区域从北纬34°34′到40°44′横跨6个纬度，海拔从180 m到3 058 m，地貌类型复杂多样，全省各县均有谷子资源分布，形成了多类型谷子种植区，按照纬度和海拔分为春播早熟区、春播中熟区、春播晚熟区和夏播区[35]。山西谷子核心资源按照11个地市来源划分成3个类群，基本按照纬度高低由北到南划分开来[36]，说明山西谷子种质资源存在地理生态型分化，也从分子水平证明了山西省是春、夏谷2种类型同时存在的省份。同时，明确了各地市谷子资源的遗传距离，为山西谷子生态区域划分和育种亲本选配提供了分子证据。

表3 GLM和MLM关联分析

SN：节数；PH：株高；PL：颈长；LW：叶宽；DMS：茎粗；PL：穗长；PD：穗粗；PBNP：码数；SNPB：码粒数；GW：千粒重；PC：蛋白含量；GLM：一般线性模型；MLM：混合线性模型

SN: stem node number; PH: plant height; PL: peduncle length; LW: Leaf width; DMS: diameter of main stem; PL: panicle length; PD: panicle diameter; PBNP: primary branch number per panicle; SNPB: spikelet number per primary branch; GW: 1000-grain weight; PC: protein content; GLM: general linear model; MLM: mixed linear model

3.2 SSR位点连锁不平衡及关联分析

已有研究表明[22,24]，谷子LD衰减距离在15—40 cM，说明谷子的LD水平较高，有利于进行全基因组关联分析，进而发掘种质资源中的有利基因。本研究利用覆盖全基因组的96对SSR引物进行标记扫描，4 560个位点成对组合中，不论是共线性组合还是非共线性组合，都有LD存在。统计概率（<0.01）支持的LD成对位点占42.9%，较高水平的LD成对位点（>0.5）主要分布在第1、第2、第6和第9染色体上及与其组合的位点，说明这4条染色体面临的选择压力大于其他染色体，这些材料多经历了较多农艺性状的选择。本研究发现核心资源的整体连锁不平衡水平较低（平均值为0.23），说明山西谷子资源在经历人为重组和自然突变的历程较少，且谷子是自花授粉作物，自然异交率低，地方品种中携带的大量优异等位变异仍单独存在，所以山西谷子育种仍有进一步提升空间。关联分析在极显著（<0.01）条件下共检测到14个与农艺性状和蛋白质含量相关的位点，对表型变异解释率平均值为5.98%，在谷子育种中可利用这些标记进行材料的等位变异标记辅助选择研究；另外，有6个标记位点同时与2个以上性状相关联，其中B142位点与4个性状相关联，这可能是性状相关和一因多效的遗传基础，说明这些标记可以同时进行改良多个目标性状，可用于多个性状的聚合育种研究。

4 结论

595份谷子核心资源遗传结构存在3个类群，11个地市按照纬度由高到低划分成3类，山西谷子资源存在地理生态型分化。共线性或非共线性位点组合都有LD存在，核心资源群体有利于关联分析和优异等位变异挖掘。2种关联模型下分别找到12个与节数、株高、颈长、茎粗、穗长、穗粗、码数、码粒数、蛋白质含量相关联的标记和9个与节数、颈长、叶宽、茎粗、穗粗、码数、码粒数、千粒重相关联的标记。

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Population Structure and Association Analysis of Main Agronomic Traits of Shanxi Core Collection in Foxtail Millet

WANG HaiGang, WEN QiFen, MU ZhiXin, QIAO ZhiJun

(Institute of Crop Germplasm Resources of Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031)

The objective of this study is to detect the SSR markers associated with agronomic trait and analyze genetic diversity and genetic structure of foxtail millet landrace in Shanxi province. The results will be helpful for hybridization combination of parent materials and molecular marker assisted breeding.96 SSR markers on 9 chromosomes were genome-wide screened for polymorphism in core collection of 595 accessions. PowerMarker 3.25 software was used to estimate the polymorphism information of population. Population structure was analyzed using STRUCTURE 2.3.4 software. Then the data were associated with 96 SSR markers by GLM (general linear model, Q) and MLM (mixed linear model, Q+K).Totally 828 alleles were found with 96 SSR markers and 8.6 alleles were revealed with each marker in average ranged from 2-26. The gene diversity was from 0.005 to 0.941, averagely 0.610. The polymorphism information content (PIC) value ranged from 0.005 to 0.938 with the mean of 0.577. Heterozygosity per locus on average was 0.016, ranging from 0 to 0.050.All the 595 accessions were divided into three subgroups by analysis of population genetic structure. There was linkage disequilibrium (LD) among linked loci and unlinked loci pairs, and 1 955 out of 4 560 loci pairs (42.9%) had significant LD (< 0.01) with average′ value of 0.23. A total of 12 locus found by GLM method significantly at the level of<0.01 which explained 2.34%-13.94% of the phenotypic variance and the mean value was 6.33%. CAAS2050 (2=13.94%) and B153(2=11.36%) kept the max value. Meanwhile, 9 loci were found by MLM method significantly at the level of<0.01 which explained 2.80%-9.22% of the phenotypic variance and the mean value was 5.16%. P89(2=9.22%) and P3*(2=8.28%) kept the max value. A total of 7 loci were detected in common by GLM and MLM.Genetic diversity and population structure of 595 accessions were analyzed through SSR markers. In the two association analysis models, 12 markers were associated with nine traits including stem node number, plant height, peduncle length, diameter of main stem, panicle length, panicle diameter, primary branch number per panicle, spikelet number per primary branch, protein content by GLM. Nine markers were associated with eight traits including stem node number, peduncle length, leaf width, diameter of main stem, panicle diameter, primary branch number per panicle, spikelet number per primary branch, 1000-grain weight by MLM.

foxtail millet; Shanxi; landrace; SSR; genetic diversity; linkage disequilibrium; association analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.013