全身性机械振动载荷修复2型糖尿病皮肤软组织创伤的实验研究

吴 敏，邵 希，景 达，葛淑华*

（1.空军军医大学第一附属医院呼吸内科，西安 710032；2.空军军医大学军事生物医学工程学系，西安 710032）

0 引言

2型糖尿病（又称成人发病型糖尿病）是临床上最为常见的内分泌代谢性疾病，患病人数占临床糖尿病总患病人数的90%，而且随着我国人口老龄化进程的加剧，呈现出逐年递增的趋势[1-2]。2型糖尿病患者的创伤愈合障碍是最为常见且最棘手的临床并发症之一。2型糖尿病患者中糖尿病溃疡的发生率约为25%，而这其中的70%在进行治疗后的半年其创口仍难以充分愈合[3]。正常组织的损伤修复涉及到炎性反应、组织新生、血管再生和组织塑形重建等阶段，而2型糖尿病对于上述各修复阶段均产生显著的破坏效应，导致创伤组织延迟愈合[4]。糖尿病的创伤愈合障碍对2型糖尿病患者的生活质量产生了较大影响，并显著提高了2型糖尿病的致残率和致死率。

在创伤的修复过程中，局部的力学因素对于伤口位置的细胞和组织新生发挥重要作用[5]。而通过外源性地施加力学手段加速组织创伤修复也有大量的文献报道[6-7]。近年来，学者们发现低强度（<0.5g）、高频率（30~100 Hz）的周期性全身机械振动载荷（whole-body vibration，WBV）刺激能够显著加速骨折愈合修复并对抗骨质疏松[8-9]。同时，学者们也发现了WBV刺激能够显著加速皮肤的创伤愈合进程，改善软组织的损伤修复能力[10-11]。但是，周期性的WBV刺激是否能够改善糖尿病（尤其是占比最多、危害最大的2型糖尿病）的创伤愈合障碍，目前国内外尚未见相关的文献报道。本研究中使用2型糖尿病的db/db小鼠作为研究对象，系统探究周期性的WBV刺激对其创伤修复速率、软组织抗张强度、组织病理性特征以及炎性和血管再生相关细胞因子表达的影响，旨在系统阐明周期性WBV刺激对于2型糖尿病皮肤损伤修复的改善效果及初步干预机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

戊巴比妥钠麻醉液，购于美国Sigma公司；便携式血糖仪，购于美国Johnson公司；Tegaderm透明伤口敷料，购于美国3M Health Care公司；生物组织力学测试系统，购于东莞昆仑检测仪器有限公司；数码照相机，购于日本Canon公司；高斯计，购于美国Lakeshore公司；组织切片机，购于德国Leica公司；ELISA试剂盒，购于武汉华美生物工程有限公司；周期性WBV加载系统，课题组自制；WBV强度测量仪，购于上海星晟检测仪器有限公司。

1.2 实验分组和皮肤创伤模型建立

3月龄雄性db/db小鼠（C57BKS背景，BKS.Cgm+/+Leprdb/J）及与其同背景的野生型小鼠，购于美国Jackson实验室。全部动物饲养于温度（22~24℃）、相对湿度（50%~60%）和光照（12 h/12 h光-暗循环）精确可控的动物实验室中。待充分适应环境一周后，通过尾静脉取血（清晨取样），使用便携式血糖仪测量db/db小鼠随机血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L的小鼠被纳入本实验。整个实验共分3组：Wild type野生型小鼠组（Control组）、db/db小鼠组（db/db组）及db/db协同以周期性WBV刺激组（db/db+WBV组），每组均为16只小鼠。于全部3组小鼠背部构建软组织创伤模型，实验步骤：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，使用皮肤活检针在小鼠背部构建直径1 cm的圆形伤口，充分分离皮肤、皮下组织和肌纤膜组织，并覆盖以Tegaderm伤口敷料以保持伤口湿润。术后注射青链霉素合剂预防伤口感染。分别于软组织创伤模型建立后的第5、12、19天处死每组4只小鼠，每组剩余的4只小鼠用于观察伤口完全愈合所需时间。db/db+WBV组小鼠在创伤模型构建后立即施以周期性WBV刺激，每天治疗2次（间隔8 h），每次30 min。本研究中的动物实验操作全部由空军军医大学实验动物伦理学委员会授权批准。

1.3 周期性WBV刺激

使用课题组自行设计研制的周期性WBV刺激系统对db/db小鼠施加周期性WBV刺激。在WBV刺激过程中，小鼠被放置于实验笼中，实验笼置于尺寸为 30 cm×30 cm×30 cm（长×宽×高）的 WBV 刺激平台上。WBV刺激平台由一个电磁式机械促动器驱动，该促动器与功能发生器相连，在动物身上产生垂直方向的振动动作。将WBV强度测量仪与WBV刺激平台紧密相连，对传递给小鼠的机械信号进行检测。WBV刺激平台以正弦波形向db/db小鼠施加周期性WBV刺激，垂直加速度为0.5g，频率为45 Hz。Control组和db/db组的小鼠同样放置于WBV刺激平台上，但不施以WBV刺激。

1.4 伤口闭合率的检测分析

分别于皮肤损伤术后的第0、5、12、19天使用数码照相机拍摄小鼠背部伤口愈合情况。使用戊巴比妥钠麻醉每组4只小鼠并将其固定于观察台上，然后将数码照相机置于小鼠正上方20 cm处对伤口进行拍摄。使用课题组自行编制的MATLAB程序对伤口图片进行自动识别（基于颜色阈值、边缘提取等图像分析算法）并对伤口面积进行量化分析。以创伤愈合率作为评估伤口愈合情况的标准，创伤愈合率以第0天与第n天的伤口面积之差除以第0天伤口面积表示[12]。

1.5 伤口组织抗张强度检测分析

分别于皮肤损伤术后的第5、12、19天处死各组动物后，迅速提取伤口及周围软组织样本，并将其修剪成8 mm×8 mm的方形条带。随后将方形条带置于生理盐水溶液中以避免组织力学性能发生变化。采用生物力学材料测试系统进行组织拉伸试验：皮肤条固定在张力计的2个夹子之间，伤口部位位于2个夹子的中线处。通过2个夹钳的移动（速度20 mm/min）向条带施加拉力。当观察到试样最终破裂时，记录此时的载荷，即为最大断裂载荷。

1.6 伤口组织病理染色和ELISA检测分析

取伤口附近的用于生物力学测试剪裁后剩余的软组织，尺寸约为5 mm×3 mm，将其固定于10%中性福尔马林中，随后进行石蜡包埋，用锯片切片机切割为5 μm厚的切片。切片脱皮复水，HE染色，光学显微镜下观察载玻片。ELISA检测使用武汉华美生物工程有限公司的ELISA商业试剂盒，检测指标分别为白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素（Ang1），所有操作严格按照试剂盒的说明执行。

1.7 统计学检验分析

本实验中所涉及的数据结果均以平均值±标准差的形式表示，使用Microsoft SPSS 22.0统计软件进行数据的分析。使用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态分布检验及使用Levene检验进行方差齐性评价的基础上，采用单因素方差分析（ANOVA）评价3组间差异的存在性。如果检测到显著性差异，则采用Bonferroni分析来确定每两组之间差异的显著性。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 周期性WBV刺激对2型糖尿病db/db小鼠血糖和体质量的影响

Control、db/db、db/db+WBV 3 组小鼠在皮肤组织创伤模型建立后的第5、12、19天的体质量和血糖水平如图1所示。与Control组小鼠相比，db/db组小鼠和db/db+WBV组小鼠在术后各时间点的体质量和血糖值均显著升高（P<0.01）。但是，db/db组小鼠与db/db+WBV组小鼠在术后的第5、12、19天的体质量和血糖值均无显著性差异（P>0.05）。结果表明，周期性WBV刺激对2型糖尿病db/db小鼠的体质量和血糖未产生显著影响。

图1 周期性WBV刺激对db/db小鼠体质量和血糖的影响

2.2 周期性WBV刺激对2型糖尿病db/db小鼠创伤愈合率和总愈合时间的影响

Control、db/db、db/db+WBV 3 组小鼠在皮肤组织创伤模型建立后的第5、12、19天的创伤愈合率如图2（a）所示。db/db 组小鼠在术后的第 5、12、19 天的创伤愈合率均显著低于Control组（P<0.01，在术后第5、12、19天分别减少了54.2%、35.2%和30.1%），提示db/db小鼠表现出典型的创伤愈合障碍。与db/db组相比，db/db+WBV组小鼠在皮肤组织创伤模型建立后的第5、12、19天的创伤愈合率显著升高（P<0.05，在术后第 5、12、19 天分别增加了 92.0%、31.1%和23.5%）。3组小鼠的创伤总愈合时间如图2（b）所示。db/db组小鼠相比于Control组创伤总愈合时间增加了74.2%（P<0.01），但db/db+WBV组小鼠的创伤愈合时间较db/db组小鼠减少了27.6%（P<0.05）。

图2 周期性WBV刺激对db/db小鼠创伤愈合率和总愈合时间的影响

2.3 周期性WBV刺激对2型糖尿病db/db小鼠伤口组织抗张强度的影响

Control、db/db、db/db+WBV 3 组小鼠在皮肤组织创伤模型建立后的第5、12、19天的伤口组织抗张强度如图3所示。与Control组相比，db/db组小鼠在术后各时间点的伤口组织抗张强度均显著降低（P<0.01，术后第5、12、19天分别减少了52.6%、44.9%和44.0%）。周期性WBV刺激在术后的第5、12、19天均显著增加了db/db组小鼠伤口组织的抗张强度（P<0.05，术后第 5、12、19天分别提高了 54.8%、32.0%和42.3%）。

图3 周期性WBV刺激对db/db小鼠伤口组织抗张强度的影响

2.4 周期性WBV刺激对2型糖尿病db/db小鼠伤口组织病理学的影响

Control、db/db、db/db+WBV 3 组小鼠在皮肤组织创伤模型构建第12天的伤口组织病理性染色结果如图4所示。db/db组小鼠的组织创伤位置在术后的第12天仍可见众多炎性细胞聚集，Control组小鼠的组织创伤位置的炎性细胞数量较少，而经周期性WBV刺激12 d后db/db组小鼠的组织创伤位置的炎性细胞数量显著减少。

图4 术后第12天周期性WBV刺激对2型糖尿病db/db小鼠伤口组织影响的病理性染色结果（HE，40×）

2.5 周期性WBV刺激对2型糖尿病db/db小鼠伤口组织中重要细胞因子表达的影响

Control、db/db、db/db+WBV 3 组小鼠在皮肤组织创伤模型建立后的第5、12、19天的伤口组织中重要细胞因子表达情况如图5所示。与Control组相比，db/db组小鼠在皮肤组织创伤模型建立后的第5、12、19天的促炎性因子IL-1β和TNF-α表达量显著升高（P<0.01），同时db/db组小鼠的血管新生相关的细胞因子VEGF和Ang1的表达量在术后的各时间点也显著低于Control组小鼠（P<0.01）。db/db+WBV组小鼠在皮肤组织创伤模型建立后的第5、12、19天的IL-1β和TNF-α表达量显著低于db/db组（P<0.05），而VEGF和Ang1的表达量显著高于db/db组（P<0.05）。

图5 通过ELISA检测周期性WBV刺激对db/db小鼠伤口组织中重要细胞因子表达的影响

3 讨论

美国Rubin教授于2001年首次提出了外源性的周期性WBV刺激能够显著增加机体的骨量，提高骨骼力学强度[13]。而随后的大量动物实验和临床研究均发现，WBV刺激能够对抗骨质疏松骨丢失进程并加速骨折的延迟愈合[8-9]。与骨组织类似，皮肤组织的损伤修复同样需要力学信号的参与，而WBV刺激同样被证实能够显著加速皮肤的创伤愈合及改善软组织的自修复能力[10-11]。但是，WBV刺激是否能够加速糖尿病（尤其是最为常见的2型糖尿病）的软组织损伤修复，目前尚不得而知。瘦素受体缺陷的db/db小鼠是目前最为常见的用于2型糖尿病研究的实验动物模型，它能够表现出典型的多饮、多食、多尿、高血糖等2型糖尿病体征，这一动物模型也已被广泛应用于2型糖尿病的各种并发症的病因学和治疗学研究[14-16]。在本实验中，同样发现了db/db组小鼠的体质量和血糖值显著高于Control组小鼠，但是周期性WBV刺激并未对db/db组小鼠的体质量和血糖产生显著影响，表明周期性WBV刺激并未对db/db小鼠的糖尿病体征产生明显的调控作用。

软组织的创伤修复是一个由炎性细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞等共同作用的复杂过程，包括炎症反应期、组织增生和肉芽形成期、伤口塑形重建期3个主要阶段，而2型糖尿病能够对上述各阶段产生显著的破坏效应，导致2型糖尿病的创伤延迟愈合或不愈合[17]。本研究结果显示，db/db组小鼠在组织创伤模型构建的第5、12、19天的创伤愈合率均显著低于非糖尿病的Control组小鼠，且db/db组小鼠的伤口闭合时间也显著长于Control组小鼠，进一步证实了2型糖尿病db/db小鼠表现出显著的伤口延迟愈合特性。而研究中也发现周期性WBV刺激从术后第5天即显现出对db/db小鼠伤口愈合修复的积极作用，且这种积极的作用效果一直持续至创伤修复的全过程。

软组织的生物力学抗张强度是一个能够反映伤口组织修复质量的关键指标，其与组织中的胶原数量和排列质量呈正相关关系[18-19]。本研究结果显示，2型糖尿病db/db组小鼠在创伤模型构建的第5、12、19天的创伤愈合修复速率均显著低于Control组小鼠，提示2型糖尿病显著破坏了软组织中的胶原数量和质量。更重要的是，研究中也发现周期性WBV刺激在术后的第5、12、19天均能够显著提升db/db组小鼠伤口组织的生物力学抗张强度。该结果表明，周期性WBV刺激能够显著改善db/db小鼠皮肤创伤修复过程中损伤周围区域新生胶原的数量和质量，而这一正向调控效应很可能在周期性WBV刺激加速db/db小鼠组织损伤修复进程中发挥重要作用。

炎性反应是软组织创伤愈合过程中的重要阶段，但是过度的炎性反应会对创伤的修复进程产生负面影响，而大量的研究也表明2型糖尿病创伤愈合过程表现出被显著延长的炎性反应过程[20]。本研究中组织病理性染色结果揭示，db/db组小鼠在术后第12天仍能观察到相比于Control组数量更高的炎性细胞数量，进一步证实2型糖尿病具有被延长的炎性反应特性。ELISA检测结果进一步表明，2型糖尿病的db/db组小鼠伤口组织周围的促炎性因子IL-1β和TNF-α的表达量在术后的第5、12、19天均显著高于Control组小鼠，证实了2型糖尿病损伤软组织中的过炎性反应状态。而组织病理和ELISA结果均揭示，周期性WBV刺激能够显著减少db/db小鼠伤口组织的炎性细胞数量并降低炎性因子IL-1β和TNF-α的表达量。上述结果提示，周期性WBV刺激具有一定的抗炎性细胞生成和炎性因子表达的积极作用。

VEGF是一种组织创伤愈合的重要细胞因子，它参与血管生成并使毛细血管通透性增加，能够反映创伤修复过程中的血管再生情况[21]。Ang1同样是伤口愈合过程中血管新生的重要标志性因子，而以往研究也揭示Ang1与VEGF在伤口愈合过程中具有相同的变化趋势[22]。本研究中ELISA结果显示，db/db组小鼠软组织中的VEGF和Ang1表达量在术后的第5、12、19天均显著低于Control组，提示2型糖尿病的皮肤创伤修复过程中血管新生过程被显著破坏。同时周期性WBV刺激在术后的各时间点均能够显著提升db/db组小鼠软组织周围的VEGF和Ang1的表达量。以上结果提示，周期性WBV刺激能够显著加速2型糖尿病软组织愈合过程中的血管新生，而这一效应可能在周期性WBV刺激加速2型糖尿病软组织创伤修复过程中发挥重要作用。

本研究中只使用了单一的WBV刺激参数（0.5g、45 Hz）对2型糖尿病小鼠进行刺激，因为该参数为一组经典的、研究学者们广泛使用的WBV刺激参数[23]。但是仍缺乏通过大规模动物实验对于WBV刺激干预2型糖尿病伤口愈合最优参数范围的筛选，这也将是下一步研究的主要方向。

综上所述，本研究从形态学、生物力学、组织病理学、分子生物学等方面系统证实了周期性WBV刺激能够显著加速2型糖尿病db/db小鼠的皮肤软组织创伤愈合修复进程，而这一积极效应可能与其对胶原沉积的促进、血管新生的加强以及抗炎性因子的表达效应具有密切关联。本研究提示周期性WBV刺激作为一种无创、经济、安全的物理治疗方法，有望成为临床2型糖尿病软组织创伤愈合修复治疗的有效作用方式。