脊髓小胶质细胞对小鼠肝脏缺血再灌注损伤后认知功能障碍的影响

鲍乐乐，姜文荃

认知功能障碍是由于多种原因导致的理解能力、记忆力、注意力、精神活动等发生障碍的中枢神经系统疾病。 老年人群神经系统退化，是认知功能障碍的好发人群［1］。临床研究表明，认知功能障碍能够增加患者的住院时间和医疗费用，甚至增加患者围术期的死亡率［2］，因此研究认知功能障碍的发病机制对临床具有重要意义。 目前认为，认知功能障碍的发病原因多种多样，中枢神经炎症反应可能是其重要的发病基础［3］，而常见的主要影响因素包括年龄、手术应激、麻醉方式、疾病类型、血栓形成等，手术操作导致的急性应激反应是加重认知功能障碍的重要因素，尤其是器官缺血再灌注损伤引起的全身性炎症反应能够加重认知功能障碍的发展［4］。认知功能障碍是老年肝脏手术患者常见的并发症之一， 肝脏缺血再灌注损伤 （hepatic ischemiareperfusion injury，HIRI） 通常发生于肝脏切除术或肝移植的患者中，短暂阻断肝脏血流是减少术中出血的常用方法，但这可直接影响患者预后，不仅加重肝脏功能损伤， 甚至引起级联性的炎症反应，通过激活网状内皮系统释放大量炎性因子，介导远隔器官如肠、脾、肺、肾甚至脊髓、大脑等中枢神经系统的损伤［5］。 因此，该研究重点讨论HIRI 是否通过激活脊髓内小胶质细胞诱发脊髓层面的神经炎症反应，参与认知功能障碍的发生发展，为临床预防肝脏手术患者认知功能障碍的发生提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂健康老年雄性C57/BL 小鼠（4月龄，25～30 g） 由中国科学院上海实验动物中心提供，12/12 h 光照条件空调室内饲养，室温22～25 ℃，湿度40%～60%，自由进水和食物。 实验所用试剂主要有戊巴比妥钠（Sigma，St. Louis，MO，USA）50 mg/kg 腹腔注射， 小胶质细胞激活抑制剂米诺环素（Minocycline）（Sigma，St. Louis，MO，USA）50 μg 进行鞘内给药，抗体主要包括小鼠来源的小胶质细胞激活标志物IBA-1（abcam，USA）、小鼠来源GAPDH（CST，USA）、 辣 根 过 氧 化 物 酶 （horse reddish peroxidase，HRP） 标 记 的 山 羊 抗 小 鼠 二 抗（CST，USA）以及小鼠IL-1β ELISA Kit（invitrogen，USA）、IL-6 ELISA Kit （abcam，USA）、TNF-α ELISA Kit（invitrogen，USA）。 小鼠随机分为四组（n=15）：假手术组 （sham）、 假手术+米诺环素干预组 （sham+minocycline）、HIRI 组、HIRI+ 米 诺 环 素 干 预 组（HIRI+minocycline）。

1.2 鞘内置管为在实验过程中对小鼠进行脊髓米诺环素给药，对小鼠均进行鞘内置管。 小鼠麻醉后腰中线备皮消毒后切开约1 cm 的小口， 剪开筋膜，一手托起小鼠，尽量暴露L3～L4间隙，用小剪刀垂直L3棘突剪开，暴露三角间隙，用小针穿破硬膜，可见小鼠甩尾反射， 夹取PE-10 导管沿穿刺孔插入，置入约0.5 cm 后可见脑脊液流出，即可封闭管口。 导管周围敷以氨苄青霉素粉末，依次缝合，妥善固定导管于肌肉和皮肤，在皮下再敷以氨苄青霉素粉末，术后单笼饲养［6］，分别在HIRI 术前1 d 以及术后1 d 给予小鼠米诺环素50 μg 进行干预。

1.3 HIRI 模型的建立通过夹闭门静脉阻断肝脏70%的血供创建HIRI 模型［7］。 腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg） 麻醉后取腹部正中切口行开腹手术，分离肝十二指肠韧带并充分暴露第一肝门，使用动脉夹小心地夹闭左肝前叶和肝中叶的肝动脉以及门静脉，并确保肝右叶和尾状叶血流通畅以产生70%的肝缺血。 60 min 后移除夹子使血液重新灌注，随后分层缝合腹部切口。 整个过程使用加温毯维持小鼠体温在36～37 ℃之间。 假手术组除未进行夹闭第一肝门血管外所有操作均相同。

1.4 血清ALT、AST 及肝脏中性粒细胞计数、湿干比测定HIRI 术后1 d 取小鼠静脉血1 ml 并常温下1200 r/min 离心1 min，通过日立747 全自动生化分析仪（德国）测定血清中的ALT 和AST 水平。 将肝组织的HE 染色切片在高倍镜下随机选取20 个视野进行中性粒细胞计数，以评价其炎症程度。 同时，切除肝组织，称量湿重（W）后放入95 ℃的电热恒温干燥箱中烘干24 h 后进行称重即为干重（D），两者比值（W/D）即为肝脏组织水肿程度。

1.5 水迷宫测试用Morris 水迷宫 （XR-XM101）分别评估HIRI 模型创建后第1、3、5、7 天小鼠的认知功能改变。 实验过程中保持水温在25 ℃左右。HIRI 前5 d 开始，每天将小鼠放入水池中使其自由游泳5 min 进行环境适应。在定位巡航阶段，将小鼠随机的在四个象限的固定入水点面向池壁放入水池，观察并记录小鼠寻找并登上隐匿于第三象限水面下平台所用时间即逃避潜伏期，若小鼠在60 s 内没能登上平台则将其引导至平台并记录60 s 为其逃避潜伏期。 随后进行空间探索实验，撤去平台，选取原隐匿平台所在象限（第三象限）的对侧象限（第一象限）的入水点，将小鼠面向池壁放置入水，观察并记录小鼠找到第三象限平台所在位置的时间，并记录其在第三象限停留的时间以及穿越平台位置的次数。

1.6 免疫荧光将小鼠麻醉后， 用0.1 mol 磷酸盐缓冲液（PBS）和4%多聚甲醛灌流。将脊髓膨大段取出后用4%多聚甲醛后固定， 并移入30%蔗糖溶液中进行脱水。用冷冻切片机（Leica，Germany）将脊髓切成20 μm 脊髓片， 在5%山羊血清中室温下封闭1～2 h，然后在4 ℃下分别加入小鼠来源IBA-1 抗体（1∶500）孵育过夜，PBS 洗3 次，5 min/次，加入山羊抗小鼠IgG（1∶1000）避光孵育2 h。 用荧光显微镜拍摄，然后通过Photoshop 软件合并。

1.7 Western Blot将小鼠麻醉后迅速取出脊髓膨大段并放入液氮中保存。将组织加入到200 μl 裂解液中（RIPA∶蛋白酶抑制剂为100∶1）超声匀浆，并在4 ℃条件裂解30 min。 裂解完成后高速离心（13 000 rpm，15 min，4 ℃）取上清。 随后用BCA 法测定总蛋白浓度并在99 ℃条件下变性10 min。 取30 μg 蛋白样本进行8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）， 采用湿转法将蛋白转移至PVDF 膜上，经5%脱脂奶粉封闭2 h 后，分别加入小鼠来源IBA-1 抗体（1∶1000）、小鼠来源GAPDH（1∶5000）一抗4 ℃孵育过夜。 TBST 洗膜3 次，5 min/次，分别加入HRP 标记的山羊抗小鼠二抗（1∶5000）室温孵育2 h，加入抗小鼠二抗（1∶5000，CST）室温孵育2 h，洗膜后加入显影液进行曝光， 使用Image J 软件分析各蛋白条带灰度值进行比较分析，其中目的条带的相对含量值为目的条带灰度值/GAPDH 灰度值。

1.8 微透析技术微透析技术用来检测HIRI 模型后脊髓层面的炎症因子的释放量。 将小鼠放置于立体定位仪上并用2%七氟烷吸入麻醉并维持， 于腰部中间皮肤切口，摘除椎板暴露部分脊髓，插入透析针，并保持透析管同脊髓在同一平面并固定。 打开微透析泵并填充透析液， 平衡2 h 后收集透析液并进行炎症因子的测定。

1.9 ELISA 测定炎症因子采用ELISA 方法测定微透析过程获得的脊髓透析液中IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎症因子的浓度。根据ELISA 试剂盒的使用说明，所有试剂均平衡至室温。 将获得的透析液按照一定比例稀释，每孔加入100 μl 的试剂盒样本稀释液， 每孔依次加入标准品和各组样本100 μl，室温孵育2 h，弃去孔内液体，用洗涤液反复洗涤4次，每孔均加入底物溶液200 μl，室温避光孵育20 min 后加入50 μl 的终止液并混匀， 静置2 min开始显色。 使用酶标仪（Eppendorf）在450 nm 波长处测定每孔的吸光度。

1.10 统计学分析采用Graphpad prism 5 进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，不同组别和时间点的数据分析采用多因素重复方差分析方法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清ALT、AST 及中性粒细胞计数、W/D 变化如图1 所示，HIRI 术后肝功能指标ALT、AST显著升高， 同假手术组相比差异具有统计学意义（图1A、1B，P＜0.05）， 说明HIRI 小鼠肝功能受损。HIRI 小鼠肝脏中性粒细胞计数以及W/D 同样明显高于假手术组 （图1C、1D，P＜0.05）， 进一步说明HIRI 导致肝脏水肿以及炎症反应增强， 提示HIRI小鼠模型创建成功。

图1 血清ALT、AST 及PMN 计数、湿干比变化

2.2 HIRI 及脊髓小胶质细胞激活对小鼠认知功能的影响同假手术组相比，HIRI 小鼠术后1、3、5、7 d 的水迷宫实验逃避潜伏期明显延长， 而通过鞘内注射米诺环素抑制脊髓小胶质细胞激活后小鼠逃避潜伏期在3、5、7 d 有所减少 （图2A，P＜0.05），且HIRI 组3、5、7 d 的目标象限停留时间和5、7 d的穿越平台次数显著减少，而通过鞘内注射米诺环素后小鼠目标象限停留时间及穿越平台次数在5、7 d 有所增加（图2B、2C，P＜0.05），差异具有统计学意义，提示HIRI 能够加重小鼠的认知功能障碍，而脊髓小胶质细胞的激活在HIRI 导致的认知功能障碍过程中发挥重要作用。

图2 HIRI 及脊髓小胶质细胞激活对小鼠认知功能的影响

2.3 HIRI 对小鼠脊髓小胶质细胞激活的影响为进一步研究小胶质细胞在HIRI 后对认知功能障碍的影响，笔者观察了脊髓小胶质细胞的变化。 免疫荧光显示HIRI 小鼠脊髓背角小胶质细胞激活标志物IBA-1 明显增加，而鞘内注射米诺环素后小胶质细胞激活有所减弱，差异具有统计学意义（图3A、3B，P＜0.05），且Western Blot 结果进一步说明HIRI上调小鼠脊髓IBA-1 蛋白的表达，而米诺环素干预减弱HIRI 对小鼠脊髓IBA-1 蛋白影响（图3C、3D，P＜0.05），提示HIRI 能够增强脊髓小胶质细胞的活动。

2.4 HIRI 对小胶质细胞介导的炎症因子释放的影响为了研究HIRI 小鼠脊髓小胶质细胞介导的炎症反应的变化，通过微透析技术收集脊髓微环境的脑脊液进行分析。 ELISA 结果如图4 所示，HIRI 小鼠脊髓内IL-1β、IL-6、TNF-α 三种炎症因子的合成释放明显增加， 说明HIRI 增强了脊髓内炎症反应， 而在鞘内注射米诺环素后浓度显著下降 （P＜0.05）， 说明小胶质细胞介导了脊髓炎症反应，HIRI通过小胶质细胞影响脊髓内炎症反应的发生进一步影响小鼠的认知功能。

图3 HIRI 对小鼠脊髓小胶质细胞激活的影响

图4 HIRI 对小胶质细胞介导的炎症因子释放的影响

3 讨 论

认知功能障碍是麻醉和手术后老年患者神经系统常见的并发症，严重影响老年患者术后恢复及生活质量，寻找围术期能够预防老年患者术后认知功能障碍的方法意义重大。 该研究发现，肝脏缺血再灌注损伤能够显著加重小鼠的认知功能障碍，而脊髓内小胶质细胞介导的神经炎性反应在此过程中发挥重要作用。

作为中枢神经系统内的一种免疫巨噬细胞，小胶质细胞在脊髓的免疫应答过程中发挥重要作用。中枢内小胶质细胞对各种炎性刺激异常敏感，神经损伤、感染和促炎因子的释放均能诱导小胶质细胞过度激活及数量增加并出现M1 极化， 进一步改变施万细胞和轴突的功能和结构特性，导致多种细胞因子的释放， 包括IL-1β、IL-6、 白血病抑制因子、TNF-α、TNF-β 等［8］。 TNF-α 作为促炎细胞因子，又可反过来激活神经胶质细胞进行神经炎症调节。 而IL-1β 在认知功能障碍的早期发展过程中起着重要作用，Cibelli 等［9］通过敲除IL-1β 受体可以显著减轻认知功能障碍的症状，抑制IL-1β 的释放可以延缓认知功能障碍的进展。 肝脏缺血再灌注损伤过程中肝脏免疫细胞释放多种促炎因子入血，通过损伤血脑屏障内皮细胞增强其通透性并大量进入中枢神经系统，激活敏感的神经胶质细胞从而激活中枢的炎症反应［10］。 同时，细胞内核转录因子NF-κB 可迅速对外界刺激做出反应，启动细胞核内相关炎症因子的转录过程，参与到中枢内神经系统的炎症反应，甚至损伤细胞线粒体功能，导致细胞内能量供需失衡，导致神经元非正常死亡，影响认知功能［11］。该文同样证实了肝脏缺血再灌注损伤显著增加了脊髓内小胶质细胞介导的炎症因子的释放，促进了认知功能障碍的发展。 同时，氧化应激在认知功能障碍的病理过程中发挥重要作用。 在肝脏缺血早期，体内主要的抗氧化系统如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等活性增高以消除氧自由基。 但当再灌注损伤发展到一定程度时这种平衡被打破，抗氧化系统功能减弱，氧自由基沉积于肝组织和脊髓、大脑神经元，炎细胞浸润和炎症因子的释放同时会造成更多自由基沉积，进一步加重神经元损伤［12］。

在术后认知功能障碍发生发展过程中起主导作用的是中枢神经系统，尤其是大脑的海马区域神经元发生炎症、凋亡等病理改变，且海马内小胶质细胞介导的一系列反应导致的神经元病理改变在术后认知功能障碍的发展中至关重要。 肝脏缺血再灌注损伤后释放的多种物质可通过受损的血脑屏障进入中枢，其可通过直接或间接的方式到达并作用于海马。 脊髓背角有特定的区域投射至大脑海马区域，此通路在神经营养因子、第二信使等存在密切交流，因此脊髓的损伤能够通过神经投射对海马区域产生重要影响，同时脊髓小胶质细胞在此过程中发挥重要作用，此为间接途径。 诚然通过药物直接干预海马区域的病理进程能够对认知功能障碍产生更直接的影响，但不可否认在脊髓层面干预对海马区域也会产生重要影响， 两者具有协同效果。另一方面，肝脏缺血再灌注损伤往往发生在肝脏手术过程中，若麻醉方法复合腰硬联合麻醉等椎管内麻醉方法，此时即可通过脊髓水平的干预对海马产生影响，从而预防术后认知功能障碍，选择缺血再灌注损伤后脊髓炎症反应对术后认知功能障碍的影响， 进一步补充解释了认知功能障碍的发病机制，但脊髓激活的小胶质细胞通过何种方式影响到海马区域，以及脊髓对海马区域影响的程度，仍有待进一步研究探索。

综上所述，肝脏缺血再灌注损伤通过小胶质细胞活化促进脊髓内炎症反应的发生，从而影响小鼠的认知功能。 因此，在肝脏手术过程中提前改变小胶质细胞的功能状态，或者通过某种方式减轻肝脏缺血再灌注对中枢神经系统的炎症影响，可以减少术后认知功能障碍的发生率，提高围术期患者生存率。