不同集约化猪场猪群内毒素水平及免疫相关因子的监测

2019-12-18李中央强煜云王圣翔赵宝玉吴晨晨

猪业科学 2019年11期

李中央，田甜，强煜云，王圣翔，赵宝玉＊，吴晨晨＊

(西北农林科技大学动物医学院/临床兽医系，陕西杨陵 712100)

动物疫情肆虐、猪场疫病频发，不断刺激着养猪人的神经，人们不禁产生疑问：为什么猪群的免疫力如此脆弱？为什么使用优质疫苗免疫应答后水平参差不齐？这一系列的疫情频繁发生主要是因为多数猪群处于亚健康状态（介于健康与发病之间的一种状态），动物的免疫系统受到抑制。当受到外界病原的攻击时，随时有爆发疾病的风险。最近研究发现，引起猪群亚健康状态的主要原因之一为内毒素蓄积。内毒素又称脂多糖（LPS），是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，在细菌生长期、稳定期以及细菌死亡崩解时会被释放出来。内毒素耐热且稳定，其化学本质不是蛋白质，即便在100 ℃下加热1 h 也不会被破坏，只有在160 ℃ 或更高的温度下加热2 ～4 h，或用强碱、强酸、强氧化剂加热煮沸30 min 才能破坏它的生物活性[1-2]。规模化猪场的内毒素来源广泛，其主要来源为：圈舍空气中的内毒素、对猪只抗生素大量使用和饲料中的内毒素[2]。猪只通过呼吸道和消化道长期摄入大量内毒素，长此以往，内毒素蓄积于动物体内细菌最大的储存库—肠道。当蓄积的内毒素破坏肠道黏膜的免疫屏障进入血液后，就会使机体的免疫功能发生紊乱。基于此，本研究选取两个规模化猪场，分别为生物安全较好的猪场（猪场-I）和生物安全较差的猪场（猪场-II），收集两猪场各个生长阶段的猪群血液，检测血液中内毒素和炎性因子水平，分析内毒素与炎性因子对猪群的影响，旨在为解决猪群亚健康状态所表现的免疫力低下，呈现的免疫抑制状态提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品的收集

我们选取了陕西省杨凌周边的2 个大型规模化养猪场。其中一个规模化猪场（猪场-I）严格执行生物安全制度，该猪场对场内运猪、运粪车辆出入生产区、隔离舍、出猪台都要彻底消毒；更衣室、工作服、生活区办公室、食堂、宿舍、公共场所和周围环境每月消毒一次；员工休假回场必须隔离一天两夜后方可进入生活区；每周至少一次对猪舍和猪群进行常规消毒，猪舍、猪群带猪消毒提倡细化喷雾消毒与熏蒸消毒；一个季度至少进行一次药物灭鼠，定期灭蝇和灭蚊；每次出猪后，对出猪台都要进行重点消毒。另一个猪场我们选择没有按照生物安全制度严格执行的规模化猪场（猪场-II）。2 个规模化猪场都常规接种猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病和猪口蹄疫疫苗。

随机选取两个规模化猪场各个生长阶段（5～8头）的新生仔猪、10日龄仔猪、3周龄仔猪、7周龄保育猪、11周龄育成猪、15周龄育成猪、19周龄育成猪、23周龄育成猪、27周龄后备种猪、30周龄后备种猪、0胎次母猪、1～2胎次母猪和3～4胎次母猪。收集每个生长阶段猪只前腔静脉血10 mL，肝素钠抗凝，3 000 r/min 分离血浆10 min，-20 ℃保存待检。

1.2 检测方法

分离2 个规模化猪场各个生长阶段猪只血浆，应用E L I S A方法检测，具体操作步骤详见试剂盒说明书。本试验主要检测因子包括：猪分泌性免疫球蛋白A（sIgA）﹝ELISA试剂盒（1190708PA45）〕、猪超敏C反应蛋白（h s-CR P）﹝E L I S A试剂盒（11 9 0 7 0 8 PA 4 6）〕、猪白介素1（IL-1）﹝ELISA试剂盒（11 9 0 7 0 8 PA 4 7）〕、猪白介素4 （IL-4）﹝ELISA试剂盒（1190708PA48）〕、猪白介素10（IL-10）﹝ELISA试剂盒（1190708PA49）〕、猪肿瘤坏死因子α（TNF-α）﹝ELISA试剂盒（1190708 PA50）〕，以上试剂盒均购于上海酶联试剂有限公司。

1.3 ELISA 检测步骤

1.3.1 标准液的稀释

150 μL 的原倍标准品加入150 μL 的标准品稀释液作为5 号标准品（400 ng/L）；150 μL 的5 号标准品加入150 μL 的标准品稀释液作为4 号标准品（200 ng/L）；150 μL的4 号标准品加入150 μL 的标准品稀释液作为3 号标准品（100 ng/L）；150 μL 的3 号标准品加入150 μL的标准品稀释液作为2 号标准品（50 ng/L）；150 μL 的2 号标准品加入150 μL 的标准品稀释液作为1 号标准品（25 ng/L）。

1.3.2 加样

分别设空白孔（空白对照孔不加样品和酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5 倍），加样将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻摇动混匀。

1.3.3 温育

用封板膜封板后置37 ℃温育

30 min。

1.3.4 配液

将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用。

1.3.5 洗涤

小心揭掉封板膜，弃去液体、甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去。如此重复5 次，拍干。

1.3.6 加酶

每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。

1.3.7 温育

用封板膜封板后置37 ℃温育

30 min。

1.3.8 洗涤

小心揭掉封板膜，弃去液体、甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去。如此重复5 次，拍干。

1.3.9 显色

每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL 轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min。

1.3.10 终止

每孔加终止液50 μL，停止反应，（此时蓝色立转黄色）。

1.3.11 测定

以空白孔调零，在450 nm 波长下依序测量各孔的吸光度（OD值），测定在加终止液后15 min 内进行。

1.3.12 计算

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值带入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.4 数据统计

采用平均值±标准差来表示试验数据。使用SPSS 13.0 (SPSS，Chicago，IL，USA) 来进行分析，包含2 个相关样本分析。结果中，概率(P)值低于0.05 可认为具有统计学意义，表示为 * P＜0.05，对猪场-I 与猪场-II 同一生长阶段猪群进行对比。

2 结果

2.1 两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液内毒素水平的变化规律

猪场-II 各个生理阶段猪群血液中内毒素的含量均显著高于猪场-I 的猪群（P＜0.05）。在猪场-II，随着饲养时间的延长，猪只体内蓄积的内毒素量也呈现上升趋势；在猪场-I，随着饲养时间的延长，猪只体内蓄积的内毒素量一直趋于平稳状态，变化幅度较小。同时发现两个规模化猪场0 胎次母猪血液内毒素的水平达到最高，随着胎次和泌乳数量的增多，母猪血液内毒素的含量逐渐下降，但猪场-II 新生仔猪血液内毒素的含量显著高于猪场-I 的新生仔猪（P＜0.05）（图1）。说明严格执行生物安全体系可以净化猪只体内的内毒素含量，并不随着饲养时间的延长而使其体内内毒素的含量增加，同时发现母猪体内的内毒素可以穿透胎盘屏障和乳汁传递给新生仔猪。

2.2 两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液sIgA 水平的变化规律

图2 所示，猪场-I 各个生长阶段猪群血液sIgA 水平均高于猪场-II。其中猪场-I 中的3 周龄仔猪、7 周龄仔猪、11 周育肥猪、15 周育肥猪和19 周育肥猪血液sIgA 的含量显著高于猪场-II 中的同期猪群（P＜0.05）；两个规模化猪场育肥猪23 周龄后血液sIgA 的含量呈下降趋势。同时发现两个规模化猪场0胎次母猪血液sIgA 的含量随着胎次和泌乳数量的增多逐渐下降。猪场-I 育成母猪体内抗体水平较高，随着日龄的增加猪只体内抗体水平逐渐下降，但是猪场-I 各个生理阶段猪群的免疫抗体水平优于猪场-II的猪群。

2.3 两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液超敏C 蛋白水平的变化规律

图1 两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液内毒素水平的变化规律

图2 两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液sIgA 水平的变化规律

图3 所示，猪场-II 各个生理阶段猪群血液超敏C 蛋白水平均高于猪场-I，其中猪场-II 中的新生仔猪、10 日龄仔猪、11 周龄育肥猪、15 周龄育肥猪、19 周龄育肥猪、23周龄育肥猪、27 周龄育肥猪、30 周龄育肥猪、0 胎次母猪、1 ～2 胎次母猪和3 ～4 胎次母猪血液超敏C 蛋白的含量显著高于猪场-I 猪群（P＜0.05）。猪场-I 中23 周龄育肥猪血液超敏C 蛋白含量达到最高，之后开始下降，而猪场-II 中各个生长阶段的猪群血液超敏C 蛋白的含量一直处于较高状态。两个猪场的母猪随着胎次和泌乳数量的增加，其血液超敏C 蛋白水平亦皆呈下降趋势，而新生仔猪体内超敏C 蛋白水平较高。说明猪场-II 各个生长阶段猪群由于体内蓄积内毒素，引起猪只体内超敏C 蛋白的水平增多。

2.4 两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液炎性因子水平的变化规律

图4 所示，IL-1 浓度：猪场-I中7 周龄仔猪、11 周龄育肥猪、19周龄育肥猪血液IL-1 浓度显著高于猪场-II 猪群（P＜0.05）；猪场-II 中0 胎次母猪、1 ～2 胎次母猪和3 ～4 胎次母猪血液IL-1 浓度显著高于猪场-I（P＜0.05）；其他各个生理阶段，两个猪场的猪只血液IL-1 浓度无显著性差异（P＞0.05）。

IL-4 浓度：猪场-I 中新生仔猪、3 周龄仔猪、7 周龄仔猪、11周育肥猪、15 周龄育肥猪、23 周龄育肥猪血液IL-4 浓度显著高于猪场-II 猪群（P＜0.05）；猪场-I 中30周龄后备猪和3 ～4 胎次母猪血液IL-4 浓度显著低于猪场-II 的猪群（P＜0.05）；2 个猪场其他各个生理阶段猪群血液IL-4 浓度无显著性差异（P＞0.05）。

图3 两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液超敏C 蛋白水平的变化规律

TNF-ɑ 浓度：猪场-I 中10 日龄仔猪、7 周龄仔猪、11 周龄育肥猪、19 周龄育肥猪、23 周龄育肥猪、27 周龄后备猪和30 周龄后备猪血液TNF-ɑ 含量显著高于猪场-II 猪群（P＜0.05）；2 个规模化猪场其他各个生理阶段猪群血液TNF-ɑ 含量之间没有显著性差异（P＞0.05）。

IL-10 浓度：猪场-I 中新生仔猪、10 日龄仔猪和3 周龄仔猪血液IL-10 浓度显著高于猪场-II 猪群（P＜0.05）；2 个规模化猪场其他各个生理阶段猪群血液IL-10 浓度之间没有显著性差异（P＞0.05）。说明猪场-II 猪群长期大量的内毒素蓄积可能对猪只血液中炎性因子水平具有显著的抑制作用。

3 讨论

猪只体内内毒素的净化与其生存环境存在密切的联系。猪场圈舍大量使用消毒剂致空气中细菌被杀死而释放出内毒素，同时猪场滥用抗生素导致内毒素在猪肠道内大量蓄积，故猪只饲养时间越长，肠道蓄积内毒素的含量越多。内毒素化学结构稳定，常作为猪免疫神经内分泌相互作用的模型[6-8]，它不会直接危害细胞或器官，但可激活免疫系统，通过单核细胞和巨噬细胞起作用。细菌内毒素还可以进入机体的血液循环系统，对血液产生毒性作用，导致内毒素血症。基于此，本试验选取严格执行生物安全的猪场和执行力较差的猪场进行试验，实时跟踪各个生长阶段猪群血液内毒素的含量变化趋势，结果发现生物安全性能好的猪场猪群体内内毒素的含量明显低于生物安全性能差的猪场。随着产仔量和泌乳量的增加，多胎次母猪血液内毒素含量逐渐减少。猪场-II 新生仔猪体内内毒素的含量均显著高于猪场-I的新生仔猪。体内大量内毒素蓄积的母猪产下的仔猪肤色较正常的淡红色深一些，且腹股沟淋巴结发暗，排清水或灰黄色奶油状稀便，持续两三天后陆续出现严重的脱水消瘦现象，断奶前死亡率接近100%。据此，我们推测生物安全性执行力较差的猪场，母猪体内蓄积的内毒素较高，妊娠的母猪可以通过哺乳和产仔把内毒素传递给新生仔猪，造成新生仔猪体内含有大量的内毒素，仔猪出现腹泻和死亡的发病率显著上升。

内毒素主要积聚在猪的肠道内，通过淋巴和血液循环进入外周血，sIgA 在肠道黏膜免疫中起到关键作用。sIgA 作为肠黏膜上的主要免疫球蛋白，是肠道黏膜上的第一道防线，对各种外界入侵的病原体都有抵抗作用[9-11]。血液中部分活化的B 细胞可通过黏膜的淋巴管进入血液循环，再经过增殖分化，生成能够分泌IgA 的浆细胞。该浆细胞首先在胞浆内合成α 链和J 链，二者分泌到胞外瞬间联结成带J 链的IgA，然后与上皮细胞表面的SC结合成sIgA，分泌到外分泌液中成为黏膜免疫的主要抗体。本次研究中，猪场-II 猪群体内内毒素水平较高，但是其猪群血浆中sIgA 水平一直低于猪场-I，可见高内毒素暴露与猪血液内sIgA 水平呈负相关，血液sIgA 水平较低反映长期内毒素蓄积导致抗体免疫应答性能降低。Iqbal 等人表明，长期暴露于内毒素下可能会加快黏膜上皮细胞将血液中的IgA 分子转化为sIgA，并促进sIgA 从血转运到黏膜外侧[12]。

图4 两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液炎性因子水平的变化规律

内毒素蓄积可引起发热和炎症反应，因此内毒素被广泛应用于研究猪和其他物种促炎细胞因子和急性期反应蛋白复杂机制的模型[13-14]。当内毒素进入血液可释放很多促炎性介导物，如细胞因子等。本试验首先分析了超敏C 蛋白，它是一种系统性炎症急性期的非特异性标记物，检测结果表明内毒素含量低的猪场-I 各个生长阶段猪群血液超敏感C 蛋白含量低；内毒素含量高的猪场-II 猪群血液超敏感C 蛋白含量随着饲养时间的延长持续升高。该结果提示，高水平内毒素可能会伴随着急性炎症的发生。因此，我们进一步分析了两个规模化猪场各个生理阶段猪群血液内炎性因子的水平，结果发现各炎症因子并不会随着内毒素水平的升高而呈现出一致的规律。猪场-I 各个生理阶段猪群血液中TNF-a 水平均高于猪场-2，且相同猪场不同周龄之间差异较大。有报道在猪体内注射低剂量内毒素后，促炎细胞因子TNF-ɑ 的血浆浓度升高[15]；同时多项研究中报道对试验动物反复暴露内毒素可能引起其内毒素耐受，导致TNF-ɑ水平降低。本试验中猪场-II 由于猪体内长期暴露内毒素，使其TNF-ɑ水平降低。炎性因子IL-1 可促进单核巨噬细胞间的抗原呈递，诱导炎症介质的释放，具有较强的制热作用。猪场-II 猪体内IL-1 水平在猪只生长后期增高趋势明显，显著高于猪场-I，这可能与猪体代谢水平有关，还需要进一步研究。Th2细胞主要是通过分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10 及IL-13 等细胞因子促进B 细胞的增殖、分化和抗体的生成，抑制Th1 细胞是IL-4 最重要的生物功能，这是Th1 细胞和Th2 细胞交叉调节的基础。Th2 细胞的主要作用是增强B 细胞的体液免疫应答。而猪场-I 各个生理阶段猪群IL-4 水平多高于猪场-II，两猪场各生理阶段猪群血液中IL-10 水平之间无显著性差异。由此可证明猪场-II 猪只体内内毒素大量蓄积倾向于Th1 介导的免疫，而猪场-I 猪只体内内毒素含量较少倾向于Th2介导的免疫。这与另一项研究中提出的内毒素暴露可促进肉鸡和肉牛体内Th2 介导的免疫应答一致[16]。这种结果可以解释为，当内毒素浓度特别高和/或动物长期暴露于内毒素时，密集饲养动物的辅助T 细胞介导的免疫可能从Th2 向Th1 倾斜。因此，虽然在特异性皮炎的急性期Th2 反应占主导地位，但慢性期的炎症与Th1 介导免疫应答上调有密切关系[17]。猪场-II 各个生理阶段猪群炎性因子水平的降低我们推测是由于大量的内毒素蓄积导致免疫细胞出现坏死，导致分泌炎性因子的水平降低，此方面的机制还有待进一步研究。