电针傍刺对褥疮大鼠创面组织中p38MAPK蛋白表达的影响*

郭玉红,孙忠人,孙 琦,李竹馨

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

褥疮又称“席疮”“压疮”和“压力性溃疡”，多因长期卧床以及护理不当使患者局部组织受压所致的皮肤破溃。作为一种临床慢性难治性疾病，严重影响了患者的生活质量和生命健康，加重了患者及家属的经济负担。褥疮的愈合是动态的、互动的过程，在褥疮愈合过程中多种细胞和生长因子参与其中，并起着重要的作用[1]。课题组研究发现电针傍刺能够促进褥疮的愈合[2]，但电针傍刺促进创面愈合的机制有待进一步研究。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)分布于细胞浆内，是生物体内重要的信号转导途径，MAPK参与了细胞的生长、发育、分化、增殖和凋亡[3]，近年来MAPK在疾病、损伤等方面的研究成为了热点。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作为丝裂原活化蛋白激酶家族成员，参与细胞增殖、分化和凋亡，并在这一过程中发挥着重要作用[4]。大量研究发现，在多种疾病中均发现了p38MAPK通路的激活，为多种疾病的发病机制及治疗提供了新方向。本研究的目的是观察电针傍刺是否通过p38MAPK通路影响创面修复，进一步探讨电针傍刺促进疮面修复的机制。

1 材料

1.1 实验动物

选用健康清洁级SD雌性大鼠，共150只，体质量220～250 g，所有实验动物均购自黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号SCXK(黑)2013-001。饲养环境 ：在室温20～25℃、湿度50%～60%的条件下，大鼠可以自由进食、饮水，置于单笼饲养。

1.2 动物分组

将150只SD雌性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、电针傍刺组、模型抑制剂组和电针抑制剂组，共5组，其中每个组再根据1天、3天、5天、7天、9天干预时间分为5个亚组，每个亚组6只。

1.3 主要仪器及主要试剂

DM4000B显微镜(德国Leica);DHP-9082型电热恒温培养箱(上海一恒);EG1160组织包埋机;HI 1220烘片机;RM2235型切片机(德国Leica);医用微波炉(青岛海尔);高速冷冻离心机(Hettich);电泳仪(美国Bio-Rad公司);制冰机(上海雪花);酶标板(Corning);涡旋混匀器(苏州捷美);酶标仪(美国宝特);转膜仪、凝胶图像分析软件(美国Bio-Rad公司)。SB203580(abcam,UK);石蜡、二甲苯(上海富宇);苏木素染液(ZS-ZLI-9610);Anti-p38MAPK antibody(ab7952)(abcam，UK);SABC(兔IgG)-POD kit(SLB-SA0021);PBS缓冲液(SLB-P1010-2);BSA封闭液(SLB-SW3015);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天);β-Actin内参抗体(上海生工)。

2 方法

2.1 模型制备

根据缺血再灌注的原理课题组自制了大鼠压疮造模装置[5]，先用尼龙扎带在铁丝网上固定住大鼠，把大鼠膝关节骨隆突处的皮肤脱毛，常规碘伏消毒，再将碘伏消毒后的装置垂直压在消毒后的皮肤上，装置的压强为100 mmHg，大鼠局部皮肤每次持续受压2 h后，放入笼中自由活动半个小时，每日循环5次，连续造模3天。

2.2 干预方法

于造模后第2日评估褥疮，将符合Ⅱ期褥疮标准(2007年美国的国家压疮专家组建议方案)[6]的大鼠纳入实验。所有纳入实验的大鼠均于第3日行干预治疗。

电针傍刺 ：用碘伏常规消毒疮面，将一根毫针(0.17 mm×7 mm)直刺在创面中心，另一根毫针斜刺在创面的边缘外0.5 cm处，再将微电流电刺激仪(频率 ：0.5 Hz，电流 ：500 μA)连接在针柄上，导线的正极置于创面边缘，负极置于创面的中心，持续30 min，每日1次。

各组褥疮大鼠的创面均用碘伏常规消毒，模型抑制剂组腹腔注射药量为5 mg/kg[7]的p38MAPK特异性抑制剂SB203580，于30 min后予以碘伏常规消毒；电针抑制剂组先腹腔注射SB203580，30 min后再采用电针傍刺治疗；模型对照组碘伏消毒前30 min腹腔注射与SB203580等量的生理盐水；电针傍刺组先腹腔注射生理盐水，30 min后再行电针傍刺治疗；正常对照组每日腹腔注射等量的生理盐水，不予以其他处置。

2.3 免疫组化检查及判定标准

免疫组化 ：将皮肤组织标本放入石蜡包埋，取创面组织小于4 μm石蜡切片，进行脱蜡、水化，3% H2O2灭活，抗原修复，PBS冲洗， BSA封闭，滴加p38MAPK一抗，4℃过夜。37℃复温20 min，PBS冲洗，滴加二抗，37℃温箱孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木紫复染，脱水，透明，封片。免疫组化结果分析 ：采用阳性着色细胞数计数法，取各组大鼠皮肤组织切片，在光镜(40×10倍)视野下，p38MAPK阳性细胞呈棕黄色的细胞浆和细胞核，随机在每张切片中选取5个不重叠视野，计数p38MAPK阳性细胞，平均数作为 p38MAPK阳性细胞数。

2.4 蛋白免疫印迹法检查

用凝胶图像处理系统将X光胶片进行灰度扫描，用ImageJ软件测量各组目标条带的光密度值，再将数据进行统计分析。

2.5 统计分析

用SPSS17.0软件分析实验数据，用均数±标准差表示计量资料，方差齐的用ANOVA，多重比较用LSD检验，方差不齐的用秩和检验。

3 实验结果

3.1 采用免疫组化方法检测p38MAPK在创面组织中的蛋白表达

在高倍镜下 ：1天，模型对照组创面组织中p38MAPK阳性细胞数显著高于正常对照组(P<0.05)，电针傍刺组P38MAPK阳性细胞数显著高于正常对照组(P<0.05)。模型对照组创面组织中p38 MAPK阳性细胞数在3天时逐渐增多，在5天、7天和9天时逐渐减少；而电针傍刺组创面组织中p38MAPK阳性细胞数在3天、5天、7天和9天时逐渐减少。腹腔注射抑制剂SB203580后，电针抑制剂组p38MAPK阳性细胞数与电针傍刺组比较减少，模型抑制剂组p38MAPK阳性细胞数与模型对照组比较减少。见表1、图1和封三彩图2。

表1 各组大鼠创面组织中p38MAPK阳性细胞数

注:同一组内相邻时间比较,△P<0.05;相同时间与模型对照组比较,☆P<0.05;与电针抑制剂组比较,▲P<0.05;与模型抑制剂组比较,#P<0.05。

注 ：同一组内相邻时间比较,△P<0.05;相同时间与模型对照组比较,☆P<0.05;与电针抑制剂组比较,▲P<0.05;与模型抑制剂组比较,#P<0.05。图1 各组大鼠创面组织中p38MAPK阳性细胞数

3.2 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测各组大鼠创面组织中p38MAPK蛋白的表达

蛋白免疫印迹结果显示,1天时，电针傍刺组p38MAPK蛋白表达与正常对照组比较显著升高(P<0.05)，与正常对照组比较，模型对照组亦明显升高，两组比较有显著性差异(P<0.05)。模型对照组p38MAPK蛋白表达在3天时逐渐升高，5天、7天、9天时逐渐下降，电针傍刺组p38MAPK蛋白表达在3天、5天、7天、9天时逐渐下降。给予抑制剂SB203580后，模型抑制剂组与模型对照组比较各干预时间点p38MAPK蛋白表达下降，电针抑制剂组与电针傍刺组比较p38MAPK蛋白表达亦下降。见表2、图3～4。

表2 各组大鼠创面组织中p38/β-Actin蛋白表达

注:同组相邻时间点比较,△P<0.05;相同时间与模型对照组比较,☆P<0.05;与电针抑制剂组比较,▲P<0.05;与模型抑制剂组比较,#P<0.05。

注 ：同组相邻时间点比较,△P<0.05;相同时间与模型对照组比较,☆P<0.05;与电针抑制剂组比较,▲P<0.05;与模型抑制剂组比较,#P<0.05。图3 各组大鼠创面组织中p38/β-Actin蛋白表达

注:Lane1代表正常对照组，Lane2代表模型对照组，Lane3代表电针傍刺组，Lane4代表模型抑制剂组，Lane5代表电针抑制剂组。图4 各组p38/β-Actin蛋白表达

4 讨论

褥疮是长期卧床的患者最容易出现的并发症，是目前康复治疗和护理工作的难题。目前，国内外医护工作者正不断探求新的更有效的治疗褥疮的方法。传统医学多采用外治法辅以内治法来治疗褥疮，因针灸具有扶正祛邪、疏经活络、祛腐生肌的作用，许多中医工作者采用针刺治疗褥疮取得了显著效果[8-10]。现代研究表明，电刺激能够增强创面处上皮细胞和巨噬细胞的活性，促进成纤维细胞的生长及血管的形成[11]。许多临床和实验研究证实电刺激能够促进皮肤创伤的修复[12-13]。电针傍刺是利用针刺和电刺激的共同作用，在十二刺法中傍针刺的基础上连接电针仪治疗褥疮的一种新的方法，体现了传统医学和现代医学的完美结合，将针刺与电刺激更好地应用到褥疮的治疗中。

本实验采用免疫组化检测p38MAPK细胞因子，结果显示 ：正常对照组大鼠皮肤组织中p38MAPK表达较弱，造模后褥疮大鼠创面组织中p38MAPK表达增强。1天时，模型对照组和电针傍刺组创面组织中p38MAPK阳性细胞数明显增多，表明p38MAPK被磷酸化而激活。电针傍刺组在3天、5天、7天和9天时p38MAPK阳性细胞数逐渐减少，p38MAPK的峰值在1天；而模型对照组在3天时p38MAPK阳性细胞数最多，在5天、7天和9天时p38MAPK阳性细胞数逐渐减少，p38MAPK的峰值在3天，说明电针傍刺促进了p38MAPK蛋白表达。给予p38MAPK特异性抑制剂SB203580后，模型抑制剂组p38MAPK阳性细胞数与模型对照组比较减少，电针抑制剂组p38MAPK阳性细胞数与电针傍刺组比较亦减少，表明SB203580通过阻断p38MAPK通路的活化抑制了电针傍刺的治疗作用。

Western Blot结果显示,1天时，模型对照组和电针傍刺组p38MAPK蛋白表达显著升高(P<0.05)，说明褥疮组织中p38MAPK被激活。3天时，模型对照组p38MAPK蛋白表达逐渐升高，5天、7天和9天时p38MAPK蛋白表达逐渐下降，模型对照组p38MAPK蛋白表达峰值在3天；而电针傍刺组p38MAPK蛋白表达峰值在1天，于3天、5天、7天和9天时逐渐下降，表明电针傍刺促进了创面组织中p38MAPK蛋白表达。在给予SB203580后，电针抑制剂组和模型抑制剂组p38MAPK蛋白表达均下降，表明SB203580抑制了电针傍刺的治疗作用。

由此可见，电针傍刺促进了p38MAPK通路中p38MAPK蛋白的表达，促进了创面的修复，而SB203580延长了创面愈合的时间，p38MAPK通路是电针傍刺促进褥疮创面修复的可能作用机制之一。