异夏佛塔苷对人非小细胞肺癌A549细胞抗肿瘤的活性及其作用机制

梁 枫，于丽丽，汪荣斌，秦亚东，戴 胜

(1.安徽中医药高等专科学校，安徽 芜湖 241000；2.中国药科大学，江苏 南京 210000)

癌症是严重威胁人类健康的疾病之一[1]。据国内最新卫生统计年鉴显示：原发性肺癌 (简称肺癌) 是最常见的恶性肿瘤之一，同时还位居恶性肿瘤死亡率的第一位[2]。鉴于恶性肿瘤的高发病率和高死亡率，科研工作者们一直在致力于寻找新的抗肿瘤药物。在我国中药抗肿瘤历史悠久，抗肿瘤中药种类繁多，资源丰富。现代药理研究表明：中药可以通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和增强机体免疫功能等途径达到抗肿瘤的目的[3-4]。

天南星来源于植物天南星Arisaema erubescens (Wall.) Schott、异叶天南星A.heterophyllum Bl.或东北天南星A.amurense Maxim.的干燥块茎[5]。其性味苦、辛，温，有毒。现代药理研究显示：其具有抗惊厥、抗肿瘤、抗心律失常、抗炎、祛痰等药理作用。异夏佛塔苷是天南星黄酮类有效成分之一，目前关于异夏佛塔苷对人非小细胞肺癌A549细胞的抑制作用研究相对较少。因此，本实验旨在研究异夏佛塔苷对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、细胞凋亡及相关蛋白表达的影响，为其作为抗肿瘤药物的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 异夏佛塔苷(批号:52012-29-0，纯度>98%)购自北京北纳创联生物技术研究院；胎牛血清和DMEM培养基均购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液均购自碧云天生物技术有限公司；胰蛋白酶、青霉素、链霉素均购自美国Sigma公司；细胞凋亡流式检测试剂盒购自美国Bioscience公司；其余无机类试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.2 细胞株 人非小细胞肺癌细胞株由中国科学院上海细胞生物研究所提供。

1.1.3 实验仪器 pH计(上海仪电科学仪器有限公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；双重纯水机(上海亚荣生化仪器厂)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；超净工作台 (江苏苏净集团有限公司)；酶标仪(美国Thermo公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；半干膜转移印(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 非小细胞肺癌A549细胞在5%CO2、37℃的恒温恒湿培养箱中用含10%FBS的DMEM培养液培养，0.25%胰酶消化传代，用于实验研究。

1.2.2 MTT法检测异夏佛塔苷对A549细胞增殖的作用 收集对数生长期的非小细胞肺癌A549细胞株，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液,10%FBS的高糖培养基重悬，计数，接种于96孔板中，每孔5×103个细胞。置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞单层贴壁后，加入含有不同浓度的异夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)的稀释液，每个浓度设置3个平行孔，其中阴性对照组为含与实验组等量细胞的细胞悬液，阳性对照组加入顺铂处理(对照组加入与给药组等体积的溶剂)，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，分别于24h、48h和72h后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养3.5～4.0h；小心弃去原培养液，每孔加入DMSO150μL，振荡15min；使结晶充分溶解后，用酶联检测仪于490nm波长处测定各孔的吸光度(A)值，溶剂对照处理的细胞为对照组，计算细胞生长抑制率。

1.2.3 双染法流式细胞术检测异夏佛塔苷对A459细胞凋亡的影响 收集对数生长期的非小细胞肺癌A549细胞株，以3×105mL接种于6孔细胞培养板，接种量1.8mL/孔。将上述细胞培养板置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养24h,然后加入含不同浓度的异夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)的10%的FBS的高糖培养基(1.8mL/孔)，不加药组作为空白对照，做好相应的标记，将上述6孔细胞培养板板置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养48h。培养结束后，0.25%胰酶消化A549细胞并收集单细胞悬液，1000g离心5min，弃去上清培养基，收集下层细胞，无菌PBS重悬A549细胞，吸取100μL细胞悬浮液置于EP管中，再加入10μL的AnnexinV-Alexa Fluor488、5μL的PI以及400μL的binding buffer,室温避光孵育30min[6]。流式细胞仪检测不同浓度的异夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)对A549细胞凋亡的影响。

1.2.4 蛋白印迹法检测异夏佛塔苷对A549细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的影响 取不同浓度的异夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)作用于A549细胞48h，0.25%的胰酶消化A549细胞并收集细胞，加入60μLRIPA细胞裂解液，悬浮细胞，避光冰浴30min，12000rpm×30min离心细胞，吸取上清液，并以BCA法进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳蛋白样品后，转膜，用5%脱脂牛奶封闭1h，封一抗过夜，TBST漂洗3次后，二抗室温孵育2h，后曝光显影。后续进行二抗孵育2h、漂洗、显色以及曝光反应，最终确定不同浓度的异夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)对A549细胞凋亡相关因子表达的影响[7]。

1.3 统计学处理采用SPSS20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以“均数±标准差”表示，采用t检验P<0.05为有统计学差异,P<0.01为有显著统计学差异。

2 结果

2.1 异夏佛塔苷对A549细胞株的增殖抑制作用异夏佛塔苷在5.0～20μmol/L浓度范围内对A549细胞具有明显的抑制作用，且随着异夏佛塔苷浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用依次增强，符合时间和剂量依赖性，且中、高剂量组作用72h基本上不存在活细胞。与空白对照组相比，具有统计学差异(P<0.05)。详见图1。

图1 异夏佛塔苷对A549细胞增殖抑制的影响

2.2 异夏佛塔苷对A549细胞凋亡的影响结果显示：与空白对照组相比，随着异夏佛塔苷浓度的增高，作用于A549细胞48h后细胞凋亡率逐渐增高(分别为：15.3%、23.1%、31.4%)说明异夏佛塔苷可诱导A549细胞凋亡,呈现剂量依赖性。详见图2。

图2 异夏佛塔苷对A549细胞凋亡的影响

2.3 异夏佛塔苷对A549细胞凋亡相关因子表达的影响结果显示：与空白对照组相比，不同浓度的异夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)作用于A549细胞48h后，随着异夏佛塔苷浓度的增加，Caspase-3、Bax表达量依次增加，Bcl-2表达量依次降低，且具有剂量依赖性。详见图3。

图3 异夏佛塔苷对A549细胞凋亡相关基因表达的影响

3 讨论

在抗肿瘤药物研发中，中药因其具有的多途径、多靶点、毒性小等优势受到科研工作者越来越多的关注。

天南星是一味传统中药材，在我国已有两千多年的用药历史。近年来，一些基础和临床实验表明天南星在治疗肿瘤方面有较好疗效，引起了国内外学者的广泛关注。天南星的抗肿瘤作用与其黄酮类成分相关，而异夏佛塔苷是其黄酮类主要成分之一，因此，我们围绕异夏佛塔苷开展了抗肿瘤的体外实验研究。

本实验中我们观察了不同浓度异夏佛塔苷对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。MTT结果表明，异夏佛塔苷对A549细胞增殖具有抑制作用，且有明显时间和剂量依赖性。我们通过流式细胞仪检测发现，Annexin-V/PI双染结果表明：与对照组相比，不同浓度的异夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)作用于A549细胞48h后可以引起A549细胞凋亡率明显增加，有剂量依赖性，差异具有统计学意义。研究表明，Bcl-2是细胞凋亡通路的关键调节因子，在肿瘤细胞中均呈现高表达，可以通过抑制Bax转位进入线粒体，进而下调Capsase-3的表达，最终导致肿瘤细胞的凋亡[8-10]。为进一步探讨异夏佛塔苷诱导A549细胞凋亡的可能机制，我们检测了被异夏佛塔苷处理过的A549细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达，Western blot结果显示：异夏佛塔苷可增加A549细胞内促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达，降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。

综上所述，本实验结果表明：异夏佛塔苷可有效抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖，通过促进Bax表达，抑制Bcl-2表达进而激活Caspase-3，最终诱导A549细胞的凋亡，在抗肿瘤方面具有重要意义与研究价值。

本项目的研究为明确中药天南星有效化学成分与药理作用之间的相关性，进一步开发和利用天南星药用资源提供实验依据。