PLAUR基因过表达对人结肠癌细胞株CD133+、CD44+细胞增殖的影响

宋国权，张迎泽，王 璇

(1.牡丹江医学院附属红旗医院普外二科；2.牡丹江医学院；3.牡丹江医学院附属红旗医院心内科，黑龙江 牡丹江 157011)

结直肠癌是现恶性肿瘤中较为常见的一种,且近年来发病率逐年攀升,且有年轻化的趋势[1]。尽管形成以手术、放化疗等多种形式为一体的精准化治疗[2]，但患者5年病死率以及复发率仍居高不下，现代医学研究认为结直肠癌早期相关的分子机制对肿瘤的预后起到关键作用[3]。肿瘤细胞与内皮细胞之间的粘附是导致肿瘤形成的最早反应之一，其中PLAUR由血管内皮细胞合成并释放，是纤溶系统中较为重要的成分。研究证明PLUAR, 不但能在正常的生理状态下发挥期重要作用,而且在肿瘤的发生、发展中也扮演重要的角色[4]。其参与调节肿瘤细胞表面的蛋白裂解活性，参与信号传导，调节细胞黏附与迁移等[5]。而CD133+、CD44+均为跨膜蛋白，是粘附分子中的一员，其性质为糖蛋白。二者不仅是PLAUR的配体更作为粘附分子介导此过程，且相关实验已表明CD44+、CD133+在多种癌症中表达显著增加[6]。为讨论与肿瘤早期发生发展相关的肿瘤粘附性因子，本实验旨在研究PLAUR与CD44+、CD133+的表达关系,以明确结肠癌早期的分子机制，为根治结肠癌提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞株CT-26购买于上海复蒙基因生物科技有限公司；CD133+、CD44+细胞为本项目组前期研究所保存；pMSCV-puro质粒载体购自上海北诺生物科技有限公司；胎牛血清和TrypLE购自美国BD公司；RT-PCR(Real Time PCR)试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司；PCR产物回收试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品；PLAUR、β-actin 的引物由上海生工生物公司合成，小鼠抗人的PLAUR单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，小鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国BD公司，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒转染表达PLAUR的细胞系的建立 制备逆转录病毒载体pMSCV和pMSCV-PLAUR并提取病毒上清液。用含10%胎牛血清的DMEM培养基对人结肠癌细胞株CT-26/CD133+细胞以及CT-26/CD44+培养，于5%CO2、37℃和饱和湿度的培养箱中培养，将构建好感染的CD133+、CD44+细胞，观察组为转染pMSCV-PLAUR的细胞株，对照组为转染pMSCV的细胞株。将转染细胞筛选得到稳定转染株，分别为过表达PLAUR的观察组CD133+、CD44+细胞和对照组CD133+、CD44+细胞,本实验重复三次。

1.2.2 Real-time PCR检测PLAUR的表达 按照试剂盒说明书抽提细胞总RNA；根据目标基因使用Oligo6.69引物设计软件计real-time PCR引物，PLAUR上游引物5’-GCAGCCGCT TGTAACTGA-3’，下游引物5’-AAGTGCGGGCTGAGGTAG-3’。将real-time PCR管移至荧光定量PCR仪模块上，设定扩增程序如下：95.0℃变性5min，94.0℃、30s，60.0℃、30s，72.0℃、30s，72.0℃、7min，共36个循环，4℃延伸保存。对60.0～94.0℃的熔解曲线进行分析。每个标本重复3次，以消除real-time PCR本身和样品本身的误差所有real-time PCR产物均经熔解曲线分析以分辨目的产物、引物二聚体和非特异性产物。

1.2.3 Western blot 方法检测PLAUR蛋白的表达情况 将观察组及对照组共两组逆转录病毒感染细胞接种于4孔板中，用PBS液冲洗并用裂解液裂解细胞后抽取总蛋白。分离总蛋白后，将蛋白转印聚偏乙烯氟化物(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜中，恒流转膜，取出PVDF膜，置于TBST缓冲液中于室温下封闭。加入一抗( 1：1000的PLAUR，1：2000的β-actin)，4℃过夜，TBST洗膜;加入二抗，TBST洗膜;显影后用光密度扫描系统测定PLAUR蛋白表达情况,本实验重复三次。

1.2.4 克隆形成能力的检测 分别将两组CD133+、CD44+结肠癌细胞分别接种,PBS缓冲液洗涤，甲醛固定，结晶紫染液染色，显微镜下观察计数，判断细胞克隆形成能力。克隆形成率 =克隆数/接种细胞数×100%,本实验重复三次。

1.3 统计学方法使用SPSS 24.0软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CD133+、CD44+细胞PLAUR mRNA的表达水平观察组与对照组比较，PLAUR mRNA的表达明显增强，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 PLAUR mRNA在两组CD133+、CD44+细胞的表达水平

2.2 PLAUR蛋白在两组CD133+、CD44+细胞的表达情况观察组中PLAUR蛋白表达水平较高，与对照组相比明显增加，差异具有显著性(P<0.05)。见表2和图1。

表2 PLAUR蛋白在两组CD133+、CD44+细胞的表达结果

图1 PLAUR蛋白分别在两组CD133+、CD44+细胞的表达结果

2.3 克隆形成能力检测结果在观察组和对照组中CD144+与CD33+分别的细胞克隆形成率见表3，观察组均高于对照组，差异具有显著性(P<0.05)，说明PLAUR过表达能增强CD133+、CD44+细胞的克隆形成能力。

表3 两组 CD133+、CD44+细胞克隆形成能力比较

3 讨论

结肠癌具有易漏诊、误诊以及缺乏特异性治疗等特点；缺乏早期诊断指标则易导致诊疗的滞后以及生存率的降低。因此，探索结肠癌早期发病分子机制，对结肠癌患者的预后及治疗变得尤为重要[7-8]。目前相关研究通过基因表达、靶向因子等方式探讨结肠癌的机制[9]，而多数癌细胞通过与血管内皮细胞的粘附作用，随着血液及淋巴液而发生转移。通过查阅相关文献发现，PLAUR由血管内皮细胞合成并释放，是一种重要的肿瘤细胞受体，缺乏跨膜及胞浆部分的单链膜糖蛋白受体，通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞表面。它必须与整合素，G蛋白偶联受体等形成共受体，激活细胞内的信号，促进细胞运动、侵袭、增殖[10]，于生殖系统、消化系统、神经系统等肿瘤中发挥了重要作用[11]。研究证实肿瘤细胞与内皮细胞之间的粘附是导致肿瘤形成的最早反应之一，PLAUR可导致组织纤维溶酶原激活物酰基化而失活[12]，促进肿瘤细胞同血管内皮细胞发生粘附反应并促进肿瘤细胞的聚集。CD44+是一组细胞表面跨膜糖蛋白，其与细胞外基质中的透明质酸、层黏连蛋白等基质分子结合；与细胞骨架蛋白，参与细胞伪足形成，并与细胞的迁移运动有关。CD133+抗原是5次跨膜糖蛋白，具有肿瘤干细胞特性，在多种实体肿瘤干细胞中均有表达，如食管癌、结直肠癌、前列腺癌等，与患者的预后效果密切相关[13]。CD133+、CD44+是与肿瘤发生发展相关的肿瘤细胞粘附因子[14-15]，其在促进肿瘤转移过程之中，起到逃避T细胞监视和攻击的作用。CD44+与CD133+同样也参与肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的粘附，在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用；因此在肿瘤细胞的诊断过程中具有一定的参考价值。此次研究是通过建立PLAUR基因过表达结肠癌细胞模型，然后通过实时荧光RT-PCR和免疫印迹法检测，证实通过上述方法可以获得pMSCV-PLAUR/CD133+，pMSCV-PLAUR/CD44+，进一步对PLAUR基因过表达的CD133+、CD44+细胞的克隆进行检测发现，结果证实PLAUR基因过表达能够增强CD133+/CD44+细胞克隆形成的能力。促进CD133+/CD44+细胞增殖。因此PLAUR在疾病检测中具有一定的临床意义。

综上所述，此研究发现结肠癌细胞株C133+/CD44+的细胞中存在PLAUR基因高表达，并证实了PLAUR过表达基因可以促进结直肠癌CD133+/CD44+细胞的克隆形成能力。PLAUR可能作为一个结直肠癌新的早期诊断及判断预后的一个重要参考指标。