PCV2疫苗和免疫接种的10年：净化能否成为事实(续1)

刘国民 宋庆庆 林文耀

摘  要：在猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）出现后的20多年，它仍然是一种对养猪业有重要经济影响的病原体。PCV2的商用疫苗在2006年首次进入美国市场，在减少感染猪的临床症状和提高产量方面起到了显著的作用。最近的研究表明，PCV2在猪场猪群中的流行性和败血症发生率有所下降。然而，新变异毒株的出现又使PCV2的流行性上升。本文将评论PCV2疫苗领域最新热点的话题，包括比较商用疫苗的免疫效果、现有疫苗对新型毒株的免疫效力、自然感染和接种疫苗在免疫力上的差异、目前PCV2疫苗研究模型的局限性以及新颖试验疫苗的研究新进展。讨论也是在未来PCV2可得到净化的前提下进行的。

关键词：PCV2疫苗;免疫接种;净化

中图分类号：S854.5+9 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2019）10-0059-04

3  PCV2疫苗对PCV2新型毒株的免疫效力

尽管猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）疫苗能有效减少猪圆环病毒2型相关疾病（Porcine Circovirus 2 Associated Diseases，PCVAD）的临床症状，但是定期出现的新的PCV2毒株或PCV2毒株的变异毒株——其中一些毒株具有更强的毒力——又重新引发了人们对PCV2疫苗是否需要进行相应的更新以能够应对新毒株以及PCV2疫苗在田间是否正在产生选择性压力的争论。Ssemadaali等（2015）详细阐述了支持这一争论的数据，这种现象并不是第一次出现。例如，犬细小病毒疫苗能够有效预防犬细小病毒病，但在采用该疫苗后流行毒株会定期更新。同样，鸡马立克氏病疫苗被认为是“漏洞疫苗（leaky-vaccines）”，因为它能够防止家禽出现临床症状，但不能防止病毒的传播，因此会影响未被列入疫苗构想中的异种毒株的进化。

自PCV2在美国的猪群中流行以来，PCV2的流行株已经发生了在两种亚型毒株之间的转换，第一次转换时主要的流行毒株PCV2b于2005—2006年出现（Cheung等， 2007），并代替了PCV2a毒株（Reiner等， 2015; Shen等， 2012）;近年来，PCV2d毒株出现并在猪群中迅速流行（Xiao等， 2015），该毒株的衣壳蛋白额外增加了一个氨基酸（Guo等， 2010）。由于PCV2的所有商用疫苗都针对PCV2a亚型毒株，研究人员随后对新出现的毒株进行了试验性研究，以评估它的致病性以及当前疫苗对该毒株的免疫效力。猪在接种疫苗后病理学损伤评分下降，病毒血症减弱，同时体内中和抗体水平提高，由此被认为免疫产生了保护作用。

大多数研究表明，PCV2疫苗可以减轻由PCV2异种毒株感染引起的临床症状，并且能够诱导机体产生抗体反应。然而，疫苗在减轻异种毒株引发的病毒血症上各不相同，病毒血症是田间试验所面临的最重要的挑战。例如，感染PCV2b的猪接种PCV2a疫苗免疫后，PCV2b引发的病毒血症会明显减轻，并且在接种后（Days Post-Challenge，DPC）约100 d，攻毒株会被清除干净。但是，利用最能够反应田间情况的试验设计，并以PCV2 PCR阳性猪为试验对象，结果显示PCV2a疫苗并不能够降低由已感染病毒所引起的病毒血症，但是能够减轻随后由PCV2b、猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Disease Syndrome Virus，PRRSV）混合感染引起的病毒血症。实验室研究表明，最新的PCV1-2b疫苗能夠完全清除同源PCV2b和异源PCV2a的攻毒毒株。然而，同样在模拟田间条件（包括多重攻毒模型）的实验室试验中，PCV1-2b疫苗比PCV1-2a疫苗对预防PCV2b感染更有效。

在PCV2d分别于2010年和2012年出现于中国和美国的猪群中后，据估计，目前美国约有37%的猪群为PCV2d阳性，这一数字强有力地证明了流行的PCV2正在不断转变基因型。与PCV2b相似，有关PCV2d的毒性是否更强的试验报告也是相互矛盾的。在一项研究中，Opriessnig等（2014b）利用从猪组织匀浆中分离到的非典型的PCV2和PRRSV的攻毒接种体比较了试验用PCV2d疫苗和商用PCV2a疫苗，结果发现攻毒的猪出现了严重的死亡，但存活的猪未表现出PCVAD症状。当自然感染PCV2b的猪用3种商用PCV2a疫苗免疫后再用PCV2d攻毒，结果发现感染猪的PCV2b病毒血症和PCV2d病毒血症都得到了减轻，但是攻毒前并没有减轻。同样，免疫猪的损伤评分值也显著降低。类似的，对自然感染PCV2b和PCV2d的猪群接种商用PCV2a疫苗，感染猪的PCV2d病毒血症减轻，同时PCV2b病毒血症完全消失。Jeong等（2015）指出，与未免疫的猪相比，免疫猪的损伤评分值下降，平均日增重（Average Day Gain，ADG）得到提高（表1）。有趣的是，在田间试验中，虽然平均日增重是评估疫苗免疫效果的最重要的指标，但是由于该试验的持续时间短和环境更可控，试验性研究所得到的数据在推断田间情况上几乎没有价值。

在最近一项评估PCV2流行情况的研究中，研究人员对73家猪场的1 097头育肥猪（2012）和27家猪场的407头母猪采集了血清样本并进行检测，结果发现育肥猪和猪场猪群的PCV2病毒血症分别为17%和52%，而2006年相应的PCV2病毒血症检测结果分别为83%和99%。这些数据表明随着时间的推移当前的PCV2免疫接种方案可以根除猪群中的PCV2。然而，该研究并未检测猪群中的PCV2d流行情况（Dvorak 等，2016），并且与Shen等（2012）的发现相反，猪场接种PCV2a疫苗的猪有较高的PCV2b病毒感染量，并且PCV2b的流行率高于PCV2a的;此外，对出现PCVAD临床症状的猪进行组织样本PCR检测，结果呈PCV2b阳性或PCV2a阳性的组织分别为65%和13%，表明PCV2b是导致猪免疫后出现临床症状的原因。此外，猪场的PCV2b流行性（Shen等，2012）和不断提高的PCV2d流行性（Xiao等，2015）不能够反映出病毒血症完全降低的试验数据。然而，疾病的发病率并没有达到PCV2新毒株出现时疫苗接种前的水平（图1）。因此，简直可以说由接种PCV2a疫苗或感染PCV2a所诱发产生的交叉保护的基本水平能够将新型毒株的影响减到最少。当现有的PCV2疫苗非常有效时，猪场所面临的最大挑战是猪群出现了高水平的病毒血症，这会影响新的毒株或重组后变异的毒株的出现，以及在有协同感染因子时会影响动物的健康。Chae（2016）综述了PCV2疫苗会影响引发呼吸道疾病综合征的其他病原体。研究协同感染以及免疫接种中致病因子相互作用是在预防PCV2上取得进展的关键。

4  评估PCV2疫苗效力的动物模型

尽管在PCV2被发现后的18年中科研人员在预防猪感染PCV2上的取得了显著进展，但是第一次成功复制仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Post-Weaning Multi-Systemic Wasting Syndrome，PMWS）是由于培养物中未知有猪细小病毒存在的情况下实现的。尽管PMWS的临床症状在协同感染模型中非常明显，但是直到最近，PCV2疫苗的大多数研究都是在单独用PCV2攻毒时进行的。缺乏能够准确复制PCVAD全部症状的模型仍然是实验室评估PCV2疫苗免疫效果上的主要屏障，并且要对就PCV2病毒血症或PCV2毒力进行的实验室研究和田间观察之间通常观察到的不一致结果负一定的责任。

许多因素，包括一些未充分描述特征的因素，都会影响PCVAD的症状，进而会影响疫苗在实验室和田间进行的效力评估结果。一些田间变量很难在实验室条件下被复制，所有的努力都旨在改善现有的动物模型。在调查研究PCVAD的过程中，猪的品种和遗传背景的差异都被认为会在一定程度上影响动物对PCV2的敏感性。品种信息经常会从实验室的疫苗研究出版物中漏掉。环境条件，即温度和饲养密度，同样会对PCVAD的发展产生显著影响，并且在可以对不同研究进行逻辑比较前可以保证不同研究之间的标准化。随着我们对PCVAD的认识不断增加，改进现有的动物模型将会缩短实验室研究结果和田间数据之间的差距，并且会对PCVAD复杂的发病机理和涉及的协同病原体的相互作用有更全面的认识。

5  PCV2疫苗介导的免疫

尽管PCV2疫苗的临床效力非常高，但是其保护机制尚不清楚。宿主对PCV2的免疫反应之前已经被广泛讨论过，中和抗体和细胞免疫（CMI）在宿主免疫应答中都起到重要的作用。临床得病仔猪和亚临床感染猪之间的主要免疫学差距是中和抗体产生的时间延迟或低水平表达，出现临床症状的猪会出现高水平的IL-10和低水平的IFN-γ应答。了解这一发现的免疫学机制和分子机制对疫苗的任何合理设计都至关重要。

最近关于PCV2抗体反应的研究已经证实衣壳蛋白的169～180号残留碱基位于一个可能的抗原表位上。细菌性表达单体所形成的蛋白免疫会针对169～180片段诱导产生高水平抗体和低水平的中和反应，而用在商品苗中杆状病毒表达的蛋白免疫则不会出现上述情况;这表明蛋白的构象在抗体反应中起着重要的作用。因此可以推断，在自然感染和免疫接种中，衣壳蛋白的蛋白水解过程的不同会针对抗原表位产生高水平的抗体，而在疫苗的病毒样颗粒中抗原表位会隐藏。可以肯定的是，现有的PCV2a疫苗和新出现的PCV2毒株之间会产生显著的交叉保护。

据观察，PCV2感染猪在没有强烈的抗体反应时不会出现临床症状，因此可以假设细胞免疫在免疫应答中起重要的作用但是可以被替代，并且在免疫猪和感染猪中细胞免疫有所不同。对有PMWS症状的免疫猪和感染猪进行比较发现，感染动物会产生有效的天然免疫，并且IL-10表达水平高，而免疫猪IFN-γ、IL-8、TNF-α和IL-1b的表达水平高。对IL-10高水平和细胞免疫的解释为，在PCV2感染猪中程序化的死亡结构域（程序性死亡-配体1和程序性死亡-配体2）会上调，可能会使细胞免疫减弱以及免疫抑制。衣壳蛋白而非复制酶或开放阅读框是IL-10上调的主要原因。PCV2在猪胎儿胸腺中被发现要先于成熟的T细胞应答，并且通过消除高亲和力的克隆来异常调节T细胞成熟。这可能是因为PCV2衣壳被认为是自身抗原，因此可以减少抗病毒反应的强度。

6  新型PCV2疫苗的优势

随着PCV2疫苗在提高经济效益和减少临床症状上的成功，近年来对提升PCV2疫苗的努力聚焦在：a）提高免疫原性和疫苗有效性;b）提高不同PCV2病毒或其他协同感染病原的覆盖率;c）开发可区分感染猪和免疫猪（Differentiation of Infected and Vaccinated Animals，DIVA）的疫苗。

在改善疫苗覆盖率的新方法中，PCV2和PCV1基因组框架被用来表达外源表位来开发双重、活的疫苗。例如在PCV1衣壳蛋白C段或嵌合PCV1-2感染克隆中表达PRRSV的保护表位，或者在PCV2中表达口蹄疫保护表位。随着PCV2b代替PCV2a成为美国的流行毒株，PCV2b疫苗变为嵌合PCV1-2b疫苗，即在PCV1的骨架中用PCV2b的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）2代替PCV1的ORF2。在实验室研究中，新疫苗对同源和不同源的PCV2毒株均有效。为了处理猪链球菌病发病率的增加，一种猪痘病毒载体被用来表达猪链球菌的类M蛋白、PCV2的ORF2和猪IL-8，能够成功诱导两种猪病的免疫反应。其他方法包括PCV2 ORF2在细菌鞭毛蛋白中的融合表达，可以同时提高Th1和Th2的应答，并在DNA疫苗表达质粒中与CpG或猪IL-8基因合并，从而提高Th1介导的免疫反应。

随着PCV2疫苗的成功，全美范围内的根除计划要求DIVA可用疫苗有实用性。之前已经提到在感染克隆中将标签插入到PCV2 ORF2的C段能够成功表达。此外针对非结构的ORF1蛋白来检测抗体反应，只在活病毒能够复制的动物体内表达，由此可以区分PCV2感染和免疫动物。

能够与DIVA性能结合的可以诱导高水平保护的疫苗，可以进一步降低感染猪的病毒血症，或者诱导产生消除性免疫，从而有能力解决慢性亚临床PCV2感染的水平。

7  PCV2根除前景

在目前来看，考虑到PCV2的疫苗效力和积极的免疫实践，最终PCV2根除的前景会成为现实。尽管临床症状可以通过疫苗得到控制，田间面临的最大问题是与自然流行毒株亚临床协同感染的发生，这会加剧协同感染，减少广泛的免疫应答和抗病性。在积极使用PCV2疫苗的国家，PCV2的流行会随着疫苗使用大幅度下降。同时一系列新的变异会在同一时间内出现。一项在猪群中使用单苗判断是否能够有效根除PCV2的研究发现，重复使用疫苗会使PCV2降低到不可察觉的水平，但是当疫苗停用后病毒会在短期内重新出现。因此关于单独使用强制疫苗是否会有效根除PCV2的数据是自相矛盾的。尽管PCV2疫苗对于预防病毒感染是很有效的，但是目前不适合治疗，因此想用现有疫苗在全美范围内根除PCV2是不可取的。合理设计抗PCV2感染的疫苗以及合理了解PCV2疫苗可能实现高水平的免疫效力和广泛的保护力。

其次，更符合习俗的根除方法是建造无疫区，在该区域内猪无PCV2，被强制免疫，并引入生物安全性的测量方法，之后逐渐推广到全美。随着PCV2发生率的降低，尋找无PCV2感染猪用作后备猪是很有可能的。尽管如此，实施这一过程中需要筛选被感染猪，这就需要找到实用的DIVA疫苗和相关的ELISA方法。想要通过单独使用疫苗实现PCV2的净化还需要更加协调、有计划性以及更多的经费。PCV2的净化在相当长的时间内将会在成本和动物健康方面带来直接和间接的益处。

（续完）

原题名：Ten years of PCV2 vaccines and vaccination： is eradication a possibility？（英文）

原作者：Zahra Afghaha、Brett Webbb、Xiang-Jin Mengc和Sheela Ramamoorthy（美国）