基于基因多态性研究老年男性骨质疏松症肾虚证的发生机制*

陈 瑜

浙江省杭州市富阳区第一人民医院 浙江 杭州 311400

本研究结合老年男性骨质疏松症肾虚证临床观察和研究基础，以生物信息学、基因多态性检测等现代技术为手段，探讨VDR、AR、CYP19基因单核苷酸多态性（SNPs）的分布差异与骨密度之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料：选择我院汉族男性就诊者和体检者178例（年龄≤60岁），其中骨质疏松症肾虚证患者98例，体检肾虚证者80例。西医诊断标准参照《中国人骨质疏松症诊断标准专家共识（第三稿）》。中医证候诊断参照全国中西医结合虚证与老年病研究专业委员会1986年制定的标准和《中药新药临床研究指导原则》。排除继发性骨质疏松、其他严重疾病干扰骨代谢者、3月内使用过其他影响骨代谢药物的患者。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 骨密度测定：采用美国好乐杰QDR-4500双能X线骨密度仪检测患者正位腰椎(L2～L4)，左侧髋部，包括股骨颈(Neck)、Wards三角、大转子(Torch)、股骨粗隆(Trock)的骨密度BMD(g/cm2)。

1.2.2 SNPs测定：采集所有受试者静脉血2.5ml，于EDTA抗凝管储存。提取外周血白细胞DNA于-20℃储存。①VDR基因等位基因测定：利用PCR对目的基因进行扩增，选用Fok I上游引物：5'-AGCTATGTAGGGCGAATCATGT-3'，下游引物：5'-TCCAAGAGAGTCAGAGGAACATC-3'。扩增反应体系20μl，包含100ng基因组DNA，dNTP混合液200μmol/L，5×PCR反应缓冲液4μl，Taq聚合酶1U，2μlPCR引物。预变性94℃，5min；变性94℃，20s，退火60℃，30s，延伸72℃，20s，循环35次。循环结束后，72℃延伸7min。对PCR产物进行胶回收保证DNA浓度及纯度。PCR产物用FokI限制性核酸内切酶(由NEB提供)酶切后，将样品置于1%的琼脂糖凝胶电泳确定基因型。②CYP19基因(TTTA)n多态性测定：利用PCR对目的基因进行扩增，选用CYP19上游引物：5'-CGGTATGCATGAGAAAGGCAT-3'，下游引物：5'-GGTCACTCCTGCCTGGGTG-3'。PCR体系与①中所述相同。PCR产物送样测序分析。③AR基因(CAG)n多态性测定：利用PCR对目的基因进行扩增，选用AR上游引物：5'-CCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC-3'，下游引物：5'-CCTCATCCAGGACCAGGTAGCCT-3'。PCR反应体系与①中所述相同。PCR产物送样测序分析。

1.3 统计学处理：采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，χ2检验用于VDR，CYP19，AR基因SNPs基因型以及等位基因频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律；两组数据组间基因型和等位基因频率的比较用χ2检验；均数比较采用t检验；两组以上均数比较采用单因素方差分析；检验水准为α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VDR基因等位基因频率分布：根据VDR基因FokI酶切结果（图1），我们对骨质疏松肾虚证老年男性患者与体检肾虚证组老年男性进行基因型及基因频率分析。如图1所示，与体检肾虚证者组相比较，骨质疏松肾虚证老年男性患者基因型分布具有显著性差异（P＜0.05），骨质疏松肾虚证患者中FF基因型较多，Ff型显著减少，f等位基因频率显著减少（c2=12.731P=0.002），提示着FF基因型可能具有较高的骨质疏松发生率（见表1）。

图1 部分样品FokI酶切结果

表1 VDR基因FokI基因型及等位基因频率

2.2 AR基因（CAG）n基因频率及与骨密度的关系：AR（CAG）n重复序列测序结果表明，全部样本AR（CAG）n重复次数介于13～33，平均21。骨质疏松肾虚症患者人群中 AR（CAG）n重复数最短为 13，最长为 34，平均值为22.67± 3.55，重 复 数 最 多 为 20（10.20%）和 23（26.53%），见表2；体检肾虚证组人群中AR（CAG）n重复数平均值为21.73±2.96，与骨质疏松肾虚症患者人群比较差异不显著（P＞0.05），重复数最多为20（32.50%）和24（10%）。结果表明AR基因（CAG）n各短串联重复序列多态性与骨密度无相关性。

2.3 CYP19基因(TTTA)n多态性分布：与体检肾虚证组相比，骨质疏松肾虚证组患者CYP19基因（TTTA）n纯合基因型TCT/TCT基因频率明显增高，杂合与纯合-/-型明显降低（P＜0.05）；骨质疏松肾虚证组患者的TCT等位基因频率明显增高（P＜0.05），见表2。

表2 CYP19基因(TTTA)n多态性分布

2.4 CYP19基因(TTTA)n多态性与骨密度的关系：CYP19基因为TCT/-、-/-型的老年男性，其腰椎L2～L3、股骨颈(Neck)、Wards、股骨粗隆的骨密度要明显低于TCT/TCT型老年男性（P＜0.05，P＜0.01）。而TCT/-、-/-型的老年男性之间比较，各部位的骨密度无显著变化（P＞0.05）。多元线性回归分析发现，CYP19不同基因型的分布与腰椎L2～L3、股骨颈、Wards及股骨粗隆的骨密度存在着显著相关（P＜0.05），见表3、表4。上述结果说明CYP19基因的TCT/-型、-/-型与低骨密度密切相关。

表3 CYP19基因(TTTA)n多态性与骨密度的关系

表4 CYP19基因(TTTA)n多态性与骨密度的相关性分析

3 讨论

中医学“骨痿”与“骨痹”的阐述，可对应骨质疏松的症状。《素问·瘘论》论述，“肾气热”是致“骨痿”的主要诱因。肾藏精生髓生骨，“肾实则骨有生气”，中医学认为肾脏与骨生理关系密切。特别是老年人肾脏虚亏，肾精不足，精不生髓，髓不足则筋骨枯萎，是为“骨痿”，可见骨质疏松症与肾虚证具关联性[1]。维生素D受体的功能及蛋白表达是受VDR基因多态性的调控的，通过VDR的调节维生素D能够在体内进一步的调节钙磷代谢平衡，促进成果细胞和破骨细胞的生长发育，并进一步的促进骨形成和骨吸收。VDR基因多态性影响骨代谢及骨质疏松症，特别是与老年女性骨质疏松症关系紧密[2]。研究表明腰椎骨、股骨颈和全身的平均骨密度与VDR多态性存在着一定的关联[3]。本研究中VDR基因多态性影响老年男性骨质疏松症肾虚证患者骨密度，与其他报道一致。

研究表明TTTA等位基因可能会造成CYP19功能编译从而影响雌激素合成过程中的芳香族酶活性进而影响了激素调节途径从而造成骨质疏松发生。文献报道了CYP19基因3号外显子的沉默多态性会导致骨质疏松发生，同时CYP19基因（TTTA）n杂合型和纯合显性型会影响绝经后妇女患骨质疏松的发病风险。本研究对雌激素合成调控基因CYP19基因多态性进行分析，发现CYP19基因（TTTA）n串联重复多态性与骨质疏松存在着显著相关性。

虽然研究表明AR可以激活破骨细胞分化因子RANKL来间接发挥作用促进骨代谢[4]。但本试验开展的雄激素受体AR基因多态性研究分析显示，AR基因（CAG）n短串联重复序列多态性与骨密度无显著相关。综上所述，本研究发现VDR、CYP19基因多态性与老年男性骨质疏松肾虚证存在相关性，这为临床诊治骨质疏松症肾虚证提供了新的线索。