益气补肾调脂方对非酒精性脂肪性肝炎小鼠氧化应激损伤的影响*

杨晴柔 严茂祥 吴黎艳 蔡月琴 陈芝芸#

1 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

2 浙江中医药大学实验动物中心 浙江 杭州 310053

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）包括肝细胞脂肪变性和脂肪性肝炎（NASH）等广泛的病理组织学异常，部分NAFLD患者可能会发展为肝硬化，最终发展为肝细胞癌[1]。尽管从肝脂肪变性发展到NASH的机制目前尚未完全阐明，但越来越多的证据表明氧化应激是导致肝组织炎症损伤的重要的机制[2]，通过抗氧化应激的干预可有效改善NAFLD的肝组织炎症程度[3-4]。笔者在临床上采用益气补肾调脂方治疗NAFLD病，取得良好疗效。本研究旨在从氧化应激途径探讨益气补肾调脂方抗高脂高果糖诱导的NAFLD小鼠肝脏炎症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：50只雄性C57BL/6小鼠，SPF级，体质量20±2g，由上海西普尔-必凯实验物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2013-0016；饲养于浙江中医药大学实验动物研究中心。

1.2 益气补肾调脂方制备：黄芪、茯苓、炒白术、淫羊藿、制首乌、生山楂、郁金、桃仁、海藻按10∶5∶4∶4∶3∶8∶3∶3∶3比例，由本院中药制剂室制成流浸膏。

1.3 主要试剂和仪器：高脂饲料（由10%猪油、5%蛋黄粉、2%胆固醇、0.5%胆盐以及82.5%基础饲料组成）及果糖由南通特洛菲饲料科技有限公司提供；BCA蛋白定量（产品号：PQ0012）为杭州联科生物技术有限公司产品，丙二醛（MDA，产品号A 003-1）、总抗氧化能力（T-AOC，产品号A015-1）、超氧化物歧化酶（T-SOD,产品号A001-1）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX，产品号A 005)试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；鼠抗8-OHdG单克隆抗体（产品号SC-39387）为美国SantaCruz产品。3D Histech数字病理切片扫描仪为匈牙利产品，precellys-24生物样品均质器为法国Bertin Technologies公司，BioTek Epoch2全波长酶标仪为美国Bio Tek公司产品。

1.4 实验方法：50只小鼠随机分成5组，即正常组、模型组以及中药高、中、低剂量组，每组10只。正常组以普通饲料喂养并饮用水自由饮用，其余4组以高脂饲料喂养并20%果糖水自由饮用，连续16周；从实验第5周起中药高、中、低剂量组每天分别以 44.24g/（kg·d）、22.12g/（kg·d）、11.06g/（kg·d）的益气补肾调脂方流浸膏灌胃，正常组、模型组以10ml/kg生理盐水灌胃，均连续灌胃12周；灌胃结束次日各小鼠空腹麻醉下摘取肝组织，HE染色光镜观察肝组织脂肪变、炎症情况，诊断标准参照“非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）”[5]；参考Folch方法[6]测定肝组织TG、CHOL含量；比色法检测肝组织T-AOC、GSH-PX水平；黄嘌呤氧化酶法检测肝组织SOD水平，硫代巴比妥酸法测定MDA水平，严格按试剂盒操作说明书进行；免疫组织化学二步法检测肝组织8-OHdG表达，染色阳性表现为细胞核/浆呈棕黄色，根据阳性细胞的着色程度及着色范围进行半定量[7]。

1.5 统计学处理：采用SPSS 17.0进行统计分析，计量资料采用单因素方差分析，计数资料采用非参数秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝组织TG、CHOL影响：见表1。

表1 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝脏TG、CHOL影响（-x ± s，mg/g，n=10）

2.2 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝组织病理学的影响：正常组小鼠肝组织结构正常，模型组小鼠肝组织出现重度脂肪变，有大小不等的脂滴沉积，肝小叶可见程度不同的散在点状坏死灶，并可见部分肝细胞气球样变；应用不同剂量的益气补肾调脂方干预后，小鼠肝组织脂质沉积仍明显，但炎细胞浸润有不同程度减轻。见图1。

图1 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝组织病理学的影响

2.3 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝组织MDA水平、8-OHdG表达的影响：见表2。

2.4 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝组织T-AOC、TSOD、GSH-PX活性的影响：模型组小鼠肝组织T-AOC、TSOD及GSH-PX活性均较正常组明显降低（P＜0.01）；中药高、中、低剂量组肝组织NT-AOC、T-SOD活性及中药高、中剂量组肝组织GSH-PX活性均较模型组显著上升（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表2 益气补肾调脂方对NASH肝组织MDA含量、8-OHdG表达的影响(±s，n=10)

表2 益气补肾调脂方对NASH肝组织MDA含量、8-OHdG表达的影响(±s，n=10)

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组正常组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组MDA（nmol/mgprot)1.93±0.44 5.15±0.55**3.36±0.27**△△3.74±0.69**△△3.98±0.54**△△8-OHdG（分）2.10±0.31 5.00±0.67**3.00±0.47**△△3.90±0.74**△4.10±0.74**△

表3 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝脏T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性的影响(±s，n=10)

表3 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝脏T-AOC、T-SOD、GSH-PX活性的影响(±s，n=10)

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组正常组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组T-AOC(U/mgprot)1.21±30.21 0.71±0.13**0.93±0.16**△△T-SOD（U/mgprot)131.73±30.27 79.69±19.23**113.89±21.25△△GSH-PX(酶活力单位/mgprot)168.17±19.85 102.57±18.09**137.22±15.62**△△0.90±0.20**△102.87±15.32**△124.05±19.69**△0.87±0.14**△98.22±12.02**△117.70±15.98**

3 讨论

“二次打击”学说是目前被大多数学者普遍接受的NAFLD发病机制，即各种因素（如遗传因素、饮食中摄入过多脂肪和果糖等）作为一次打击导致肝细胞脂肪变性及脂毒性诱导的线粒体异常，使肝脏对各种额外的促炎性损害更加敏感；在此基础上氧化应激和炎症细胞因子作为二次打击导致肝细胞受损，肝组织炎症和纤维化[8]。研究表明，反应性活性氧（ROS）产生的增加和继发于肝脂质沉积引起的抗氧化酶系统的损害是NASH发生发展的重要机制[9]。本研究发现，NASH模型小鼠肝组织TG、CHOL水平增加，肝细胞大量脂滴沉积，炎症细胞浸润，同时肝组织中脂质过氧化产物MDA含量增高，代表ROS引起DNA损伤的标志物8-OHdG表达水平增强；而TAOC下降，相关的抗氧化酶T-SOD、GSH-PX活性降低；提示脂质在小鼠肝脏中过量堆积，ROS产生增加，脂质过氧化产物增多，DNA损伤，而抗氧化酶活性被抑制，抗氧化能力下降，促使小鼠肝组织炎症发生发展。

根据NASH的临床表现、体征及发病特点，中医学认为该病发病多与过食肥甘厚味、起居失常、情志失调，久病体虚等有关，属于本虚标实之证，以脾肾虚损为主，痰湿瘀阻为标。益气补肾调脂方中黄芪、白术、茯苓益气健脾，除湿泄浊；淫羊藿、制首乌补肾壮阳益精血，合黄芪温肾阳填肾精；生山楂、郁金、桃仁消食行气，活血化瘀；海藻消痰利水；诸药合用，共奏益气健脾、补肾益肝、化痰祛瘀之功。本研究发现，以不同剂量的益气补肾调脂方干预高脂高果糖喂养的小鼠后，肝组织TG、CHOL含量较模型组明显减少，肝脏脂肪变和炎症等组织病理损伤不同程度减轻，同时肝组织MDA含量、8-OHdG表达水平较模型组下降，T-AOC、T-SOD、GSH-PX水平上调。研究结果提示，益气补肾调脂方能有效改善NASH小鼠的肝脏脂肪变及炎症程度，同时能显著减少脂质过氧化产物的生成，拮抗肝细胞DNA的氧化损伤，并提高肝组织抗氧化酶含量，表明益气补肾调脂方抗高脂高糖诱导小鼠的肝组织炎症作用可能与其抗氧化损伤有关。