茄科植物中HCT基因家族的鉴定及进化和表达分析

李倩　盖江涛　白蓓蓓　叶秀旭　王鹏

摘要：莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（shikimic acid/quinic acid hydroxy cinnamyl transferase，简称HCT）是辣椒素苯丙烷代谢途径中关键的限速酶，其催化的产物对茄科植物具有重要的生理学意义。为了探清HCT在茄科植物基因组中的状况，重点考察了其在茄科植物基因组中的分布，并利用生物信息学分析的方法，对HCT基因进行全面的鉴定，共获得拟南芥、烟草、番茄和辣椒的13条基因序列。其次，构建了HCT在茄科植物中的系统发育树，并对其进行相关的结构、功能和表达的分析。结果揭示了茄科植物中HCT基因的亲缘关系;HCT基因编码的蛋白结构域高度保守，该保守性体现在植物的结构和功能上。本研究为进一步研究茄科植物中的HCT基因的酶学及生理功能提供了基础。

关键词：茄科植物;莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶;HCT基因;辣椒素;进化;表达

中图分类号： S641.301文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）19-0065-03

收稿日期：2018-07-03

基金项目：中国热带农业科学院基本科研业务专项 （编号：1630032018023）。

作者简介：李 倩（1994—），女，安徽池州人，硕士研究生，研究方向为植物基因組学。E-mail：a827680831@163.com。

通信作者：王 鹏，博士，副研究员，主要从事植物天然产物生物技术、植物基因组学。E-mail：pwang521@163.com。

辣椒为茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum）一年或有限多年生草本植物，是人们常食用的一种风味蔬菜。研究发现，辣椒的果实中含有丰富的维生素、矿物质以及一些微量元素，可以维持人体正常的生理活动，提高身体免疫力，增强人体机能。辣椒素（capsaicin）类物质是辣椒中辣味的物质基础，早在1876年，辣椒素就由Thresh分离出来并命名，Nelson最先解析了辣椒素的结构，表明它是一种含香草酰胺的生物碱[1]，主要的物质是辣椒碱和二氢辣椒碱[2]。辣椒素的生物合成是个复杂的途径，其间会涉及到多种酶和代谢物的参与，然而本质上，辣椒素主要由苯丙氨酸途径合成的香草基胺和由支链脂肪酸途径合成的8-甲基-6-癸烯酰经辣椒素合成酶（CS）催化缩合而成[3-4]。研究者在辣椒素的合成途径中，发掘到了PAL、C4H、HCT、C3H、COMT、KAS、pAMT、ACL和FAT等多个参与辣椒素生物合成的基因[3]，查阅相关文献发现，其中莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）是在木质素生物合成路径中发现较晚的一种酶。

目前普遍认同的木质素生物合成途径大致可以分为3个步骤：（1）莽草酸途径，由植物光合作用同化产物到芳香氨基酸——苯丙氨酸、络氨酸和色氨酸的合成过程;（2）苯丙烷途径，苯丙氨酸到羟基肉桂酸及其辅酶A酯类;（3）木质素合成的特异途径，羟基肉桂酸辅酶酯类到合成木质素单体及其聚合物的过程 [5-7] 。其中研究的重点大都是放在苯丙烷途径和木质素合成特异途径这2个阶段。

HCT是控制木质素中的H-单体和G/S-单体相互转化和聚合的关键酶，在苯丙烷3-羟基化步骤上游和下游的苯丙氨酸途径中发挥着关键的双重调节作用[8-9]，其中H-单体主要呈现在禾本科植物中，而S-单体主要在被子植物中存在[6]。Hoffmann等从烟梗提取物中分离纯化出一种可以水解羟基肉桂酰基-CoA酯的蛋白质，从它的序列分析结果揭示出该烟草基因属于一种植物酰基转移酶的基因家族，其成员也具有各种功能[10]。最佳的酰基供体和酰基转移酶是香豆酰辅酶A和咖啡酰辅酶A，该酶能够催化莽草酸和奎酸酯的合成，也催化其逆反应，从而对苯丙烷途径中的木质素合成有了明确认识。

HCT在茄科植物辣椒的辣椒素生物合成通路中可催化对-香豆酰辅酶A，使其形成C3H底物的同时将C3H的产物咖啡酰莽草酸/奎宁酸进一步催化生成咖啡酰辅酶A。在木质素单体的合成通路中，不同的木质素单体形成的分水岭是C3H/HCT，其决定了植物体内的碳源流向，是苯丙烷途径中的限速酶，也是控制木质素H-单体与G/S-单体的一个关键点，木质素不同单体间的比例差异对它的含量也会有所影响[8]。木质素自身具有疏水的化学性质，在植物的生长发育过程中，既可以保持植物细胞内的水分，促进植物抵御干旱等不良生态环境，还可以提高植物抗病、抗击外来干扰，维持正常生长的能力。因此推论，对于植物中HCT基因的研究具有重要的生物学意义和功能。目前，已经从烟草[10]、拟南芥[11]、番茄[12]、桉树[13]、欧美杨[14]中克隆出来HCT基因，然而，关于HCT基因在其他茄科植物中的克隆和鉴定，国内鲜有相关的系统生物信息学研究报道。

本研究以拟南芥、烟草和番茄中的HCT基因序列作为参考，以茄科植物中的辣椒作为研究对象，通过BLAST序列比对的方法获得这些植物HCT基因家族的全部序列，利用生物信息学分析方法中的系统发育分析、聚类分析等方法，来预测和分析茄科植物中的HCT基因的相关性质和功能，为后续HCT基因的研究和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 保守结构域鉴定

把HCT基因的蛋白序列作为query访问，输入PfamA数据库开始检索，获取相应的结构域信息[15]。

1.2 数据库搜索

搜索拟南芥、烟草、番茄、辣椒的HCT基因组，各基因组数据从Phytozome中下载得到[16]。通过搜索该蛋白质的模型数据库，再从结构域进行选择，获取HCT家族的序列信息。

1.3 序列比对与进化树构建

使用probcons比对之前已经搜索到的蛋白质序列，再利用Phy ML构建与之相对应的系统发育树，之后进行1 000次bootstrap分析[17-18]，最后采用Figtree来显示构建的进化树结果。

1.4 相对表达量测定

根据番茄HCT基因的CDs序列设计引物，提取番茄样品的总RNA，反转成cDNA，筛选引物，之后做荧光定量测定相对表达量。

2 结果与分析

2.1 结构域鉴定

通过与Pfam A数据库匹配，从已知拟南芥的HCT基因的蛋白质序列中，鉴定得到了1个保守结构域，编号为PF02458.11，显示该蛋白结构域高度保守，基本占据了整个蛋白质序列的98%，存在很少的非保守序列区域（图1）。

2.2 含PF02458.11结构域的基因鉴定

为全面鉴定含有编号为PF02458.11的结构域的基因序列，选取了拟南芥（Arabidopsis thaliana）和茄科植物中烟草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）为目标物种，通过BLASTP搜索目标物种基因组的蛋白质模型文件，在BLAST结果中筛选出PF02458.11结构域的序列，最终得到13个HCT家族成员（表1）。

2.3 进化树构建

为阐述植物中HCT家族各成员的进化关系，通过最大似然法构建了HCT家族进化树，结果（图2）显示，此家族可分为2条明显的独立分支（分别命名为Ⅰ和Ⅱ），共有13条氨基酸序列，其中拟南芥1条、番茄2条、烟草4条、辣椒6条。烟草的2个HCT基因、番茄的1个HCT基因、辣椒的2个HCT基因聚为一支，说明这些基因的亲缘关系较近;烟草的2个HCT基因、番茄的1个HCT基因、辣椒的4个HCT基因、拟南芥的1个HCT基因聚为另一支，其中拟南芥单独分支，说明拟南芥与这些基因的亲缘关系较远（图3）。

2.4 HCT基因相对表达量分析

通过建立热图来进行茄科植物中番茄的HCT基因相对表达量的差异分析。测定结果（图4）表明，共有野生型和突变型2个基因型，包含3个发育时期：幼果期、转色期和成熟期，整体来看它们在基因中的表达量较符合生长发育的规律。其中野生型内的Solyc07g043670.1.1、Solyc12g006330.1.1、Solyc09g014280.1.1基因和突变型内的Solyc09g092270.2.1基因在幼果期表达量低，在成熟期表達量高。

3 讨论与结论

木质素的生物合成是植物体内碳素次级代谢的一个环节，HCT是木质素合成途径中研究较晚的一种酶，同时在辣椒素苯丙氨酸合成通路的苯丙烷C3羟基化的代谢途径中充当关键酶和限速酶的重要角色，其代谢产物在植物生长发育的生命活动过程中肩负着不可或缺的作用，这些物质的相对含量也总是与HCT基因的活性保持着关联性，因而HCT基因对于植物的生命调控具有重大的生物学意义。

本研究对拟南芥、烟草、番茄和辣椒这4种植物的13条HCT基因家族蛋白构建系统发育分析，结果显示了茄科植物之间HCT基因的亲缘进化关系，还鉴定到另一个分支的7条序列与拟南芥的HCT基因分别在2个分支，亲缘关系较远，推测这些基因可能会在茄科植物中发挥重要的生理功能，同时随着研究的深入，不断增加的HCT基因完整序列将会构建出更加丰富的系统发育树。相对表达量的测定结果显示，本试验设定的参考对象番茄符合植物生长发育的规律，在幼果期表达量低，成熟期表达量高。

目前，人们对于苯丙烷代谢途径中的基因研究较多，虽有一些关于植物中HCT基因的研究，但鲜有研究从茄科植物的HCT基因家族层面来分析它的系统进化，包括在辣椒素的相关合成通路中的生长调控影响，还有该基因的表达与辣椒辣味之间的联系，以及比较茄科植物中HCT基因的性质和功能等等一系列的问题亟待解决。因此本研究以茄科植物为研究对象，对它们的序列结构、性质、进化进行系统分析，为后续研究茄科植物中的HCT基因提供参考依据和理论基础，促进茄科植物在育种工作中的进一步发展。

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