甲基磺酸乙酯诱变筛选强耐盐旱柳愈伤组织变异体研究

王莹　郭聪　谈峰　李玉娟

摘要：为获得强耐盐旱柳愈伤组织突变体，采用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理旱柳愈伤组织，对得到的旱柳愈伤组织变异体进行耐盐性检验。结果表明，0.4% EMS处理3 h为旱柳愈伤组织的半致死处理方式;愈伤组织存活率和生长率会随盐浓度的升高而降低，NaCl为0.4%时，愈伤组织的死亡率为93.6%;对筛选出的愈伤组织突变体进行盐胁迫形态与生理指标检验，诱变组SOD活性、POD活性、积累可溶性蛋白的能力比对照组高，而MDA含量始终低于对照组。旱柳愈伤组织突变体在0.4% NaCl胁迫下可正常生长，而原亲本只能耐受0.2%盐浓度，诱变体比原亲本耐盐性提高了100%。

关键词：甲基磺酸乙酯（EMS）;旱柳;强耐盐性;愈伤组织;变异体

中图分类号： S792.120.5;Q813.1+2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）19-0057-04

收稿日期：2018-06-28

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（16）1005、CX（17）1004]。

作者简介：王 莹（1986—），女，江苏南通人，硕士，助理研究员，主要从事耐盐苗木新品种培育及配套栽培技术方面的研究。E-mail：466625450@qq.com。

通信作者：李玉娟，副研究员，主要从事园林植物的育种、繁殖与栽培研究。E-mail：lyglyj90@sohu.com。

旱柳（Salix matsudana Koidz）为杨柳科（Salicaceae）柳属（Salix）落叶乔木、灌木或亚灌木，在世界上分布广泛[1]，具有速生、成材早等优点，且具有一定的抗旱、耐盐、耐瘠薄、抗风沙能力，是平原地区重要的造林绿化植物，也是固堤护岸、防风固沙、净化大气和改良盐碱地的重要树种[2]。随着沿海开发被提升为国家战略之际，更多的科研工作者将沿海滩涂的综合开发与柳树耐盐性的遗传改良工程相结合进行研究。张继明等利用传统的杂交育种方式，进行多年试验，选育出3个速生且抗盐的优良柳树新品种[3];余春梅等利用分子生物学手段，在拟南芥中过量表达柳树耐盐性相关SVP1.1s基因，为选育优良耐盐林木提供重要材料[4]。但到目前为止，由于传统方法的育种限制，其耐盐等级大都仅局限于轻度或中度耐盐水平[5]，强耐盐柳或特耐盐柳成功选育或已产业化生产的报道鲜有报道，故柳树资源的开发利用受到了极大的制约。

诱变育种是一个非常规、有效的育种方式，其借用生物、化学或物理手段，在洋亚麻（Linumu sitatissimum L.）[6]、番茄（Lycopersicones culentum Mill.）[7]、紫花苜蓿（Medicago sativa）[8]等植物耐鹽新品系的培育中显示出极其重要的作用和诱人的前景。其中甲基磺酸乙酯（EMS）是一个高效、稳定的化学诱变剂，目前在植物诱变育种中应用最广泛、效果最好，诱变后产生的突变频率高，且多为显性突变体，易于进行耐盐突变体的筛选和育种[9]。近年来，育种工作者们通过EMS诱导耐盐突变体途径，已成功获得了耐盐番茄[7]、耐盐纤维亚麻[10]、耐盐菊花[Dendranthema morifolium （Ramat.） Tzvel.][11]等多种不同耐盐等级的突变体植物新品种，大大丰富了耐盐植物的种质资源，对功能基因组学研究亦具有非常重要的作用。因此本研究在前期选育的强耐盐柳树新品系的基础上，通过EMS人工化学诱导形成柳树强耐盐突变体方式，进一步在细胞水平上进行NaCl定向筛选，以期为旱柳强耐盐品种的选育提供基础材料，为耐盐碱植物的选育提供一种高效的育种方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年3月在江苏沿江地区农业科学研究所组培实验室进行。在本项目组前期建立的旱柳愈伤组织繁育体系基础上，选取长势一致的健壮旱柳愈伤组织作为供试材料，进行EMS诱变处理及盐胁迫试验。

1.2 方法

1.2.1 EMS诱变处理及半致死量的确定 将旱柳愈伤组织放入无菌三角瓶中，加入不同浓度的EMS（0、0.2%、0.4%、0.6%）分别浸泡1、2、3、4 h，无菌水冲洗干净后接种于培养基中，2周后统计成活率，最终确定旱柳的EMS最佳半致死剂量。

1.2.2 强耐盐愈伤组织突变体的筛选 采用多步正筛选法，分别配制含愈伤组织诱导分化培养基，选取生长健壮的旱柳愈伤块，分别接种于不同NaCl（0、0.4%、0.6%、0.8%）培养基中，每7、14、21 d进行取样，统计愈伤组织成活率和生长率，确定NaCl的95%致死剂量。

1.2.3 强耐盐愈伤组织突变体耐盐性及稳定性分析

1.2.3.1 临界浓度NaCl胁迫下继代次数对愈伤组织存活率的影响 将筛选获得的旱柳强耐盐愈伤组织回接到无压力的基本培养基中，然后选择生长旺盛的愈伤组织再返回接到含NaCl（临界浓度）的筛选培养基中，每2周继代1次，共继代6次，通过测定愈伤组织存活率，确定其耐盐稳定性。

1.2.3.2 临界浓度NaCl胁迫对突变体愈伤组织各种耐盐性指标的影响 将获得的强耐盐旱柳愈伤组织突变体转入不含盐的诱导培养基上培养3代后，再转入含不同浓度NaCl（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%）的筛选培养基上培养，对照也培养相同时间，每30 d取样，测定过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量等相关耐盐生理生化指标，并与原亲本相关指标进行对比。

1.3 数据处理

采用Excel 2010进行试验数据整理、计算及作图。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变处理及半致死量的确定

从表1可以看出，旱柳愈伤组织成活率随处理时间的延长或EMS浓度升高而降低。在不加EMS条件下，愈伤组织的存活率均为100.00%;低浓度EMS处理对愈伤组织的杀伤力较弱，其平均存活率仍在60%以上;而当EMS浓度达到06%及以上时，愈伤组织存活率较低。用0.4% EMS处理 3 h 条件下，其愈伤组织存活率达49.67%。最终根据50%致死剂量和存活率确定旱柳愈伤组织最佳处理方式为0.4% EMS浸泡3 h。

2.2 强耐盐愈伤组织突变体的筛选

采用多步正筛法對旱柳强耐盐愈伤组织突变体进行筛选，如图1、图2显示，旱柳的愈伤组织存活率和生长率均随盐浓度的升高而降低。在NaCl的浓度低于0.2%时，盐浓度对愈伤组织的成活率和分化率影响不大;当NaCl浓度达到0.4%时，旱柳的愈伤组织存活率为6.3%，生长率也表现出相似的趋势;0.6% NaCl处理时，愈伤组织几乎不生长或生长受到严重抑制;而0.8% NaCl胁迫条件下，愈伤组织全部褐化死亡。根据NaCl对旱柳愈伤组织的95%致死剂量率和继续培养过程中愈伤组织的分化率表现，最终确定满足试验要求的NaCl临界浓度为0.4%。

2.3 临界浓度NaCl胁迫下继代次数对愈伤组织存活率的影响

在临界浓度NaCl（0.4%）胁迫下继代6次，结果如图3显示，通过诱变处理得到的旱柳愈伤组织在盐胁迫下能表现出相对稳定的耐受性，且随着继代次数的增加，存活率均能保持在50%以上，尤其在第3代时存活率最高，达到76.7%。

2.4 NaCl胁迫对突变体愈伤组织各种耐盐性指标的影响

2.4.1 不同NaCl胁迫对旱柳愈伤组织突变体SOD活性的影响 SOD活性的强弱，是植物抗逆性的重要指标之一。由图4看出，与对照组相比，诱变组的旱柳愈伤组织SOD活性明显高于对照愈伤组织;0.2%浓度盐胁迫下，对照组SOD活性最大;诱变组在0.4%浓度NaCl条件下活性最大，培养 30 d 时诱变的愈伤组织SOD活性最高，是对照组的2.46倍;60 d 时对照组SOD活性最低，仅为9.54 U/mg。这说明，在盐胁迫条件下，诱变组愈伤组织具有较高的SOD活性，来保护膜系统。

2.4.2 不同NaCl胁迫对旱柳愈伤组织突变体POD活性的影响 POD是存在于植物细胞中最重要的清除自由基的酶类之一。由图5可以看出，当旱柳愈伤组织处于逆境胁迫条件下时，POD活性先升高再下降，且诱变组POD活性均高于对照组;在培养30 d时，0.4% NaCl胁迫时POD活性达到最高值，为100.8 U/（g·min）。变异体愈伤组织在受到盐胁迫时，比对照POD活性高，说明诱变组愈伤组织比对照组具有更强的耐盐适应性。

2.4.3 不同NaCl胁迫对旱柳愈伤组织突变体MDA含量的影响 MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一。MDA含量的多少可代表膜损伤程度的大小。由图6可知，诱变组的MDA含量始终低于对照组。愈伤组织在盐胁迫条件下，随着处理时间的延长，对照组MDA含量先增加后下降;0.2%浓度盐胁迫下，对照组培养30 d时MDA含量达到最大值（0.615 nmol/mL），是相同处理条件下诱变组的1.42倍。诱变愈伤组织的膜损伤程度低于对照，诱变愈伤组织比对照愈伤组织更适应盐胁迫环境。

2.4.4 不同NaCl胁迫对旱柳愈伤组织突变体可溶性蛋白含量的影响 由图7可见，随着NaCl浓度的升高，对照组可溶性蛋白含量先增加后降低;在NaCl浓度0～0.4%，诱变组可溶性蛋白含量随NaCl浓度的升高而升高，当NaCl浓度为04%时，培养60 d时诱变组可溶性蛋白含量最高，为对照的 6.19倍，说明耐盐愈伤组织变异体在盐胁迫条件下积累可溶性蛋白的能力大大强于对照。

3 结论与讨论

EMS诱变技术是应用最为广泛的农作物新品种育种技术之一，育种家们利用EMS诱变已成功创制出了大批具有高产、优质、抗病、抗逆等优良农艺性状的新种质资源[12-14]，而在林木诱变育种工作中尚不多见。本研究在明确适于旱柳的最佳EMS诱变条件基础上开展大规模EMS诱变处理，首次构建了旱柳愈伤组织EMS突变体库。在0.4% EMS浸泡处理3 h诱变条件下，获得了一批旱柳愈伤组织突变体;再经NaCl胁迫与逐级筛选，最终获得了一批耐盐性优良的愈伤组织;通过生长状态观察与生理指标测定，旱柳愈伤组织突变体在0.4% NaCl胁迫下可正常生长，而原亲本只能耐受0.2%盐浓度，诱变体比原亲本耐盐性提高了100%。本研究为耐盐柳树种质创新以及功能基因组学研究提供了基础性材料。

EMS诱导涉及复杂的物理、化学过程，虽然突变效果明显，但不同的材料适宜的处理浓度及诱导时间均有很大的差异，必须正确地掌握EMS诱变剂的最佳剂量、浓度以及处理时间。刘威等研究甲基磺酸乙酯的特性时发现，20 ℃下EMS半衰期为93.1 h，产物易溶于水且形成无诱变作用但对愈伤组织有一定毒害作用的有机酸，处理时间越长毒害作用越强，选择最适宜诱变剂浓度和处理时间尤为重要[15]。Bidabadi等在用EMS诱变香蕉茎尖时发现，不同的香蕉品种对EMS耐受的半致死浓度不同[16]。张大燕等采用多浓度EMS对川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）进行不同时间段的处理，筛选出了最佳的浓度与时间组合[17]。一般随着EMS浓度的升高，材料致死率也会逐渐升高，本次试验中也发现高浓度、长时间处理旱柳愈伤组织，会导致组培材料的存活率和生长率明显降低，这与前人的EMS处理结果相似。同时研究过程中，在构建的旱柳愈伤组织诱变体库时，一部分材料在受到临界浓度盐胁迫时，突变性状在后代中未能得到稳定遗传，尤其是第1次继代，成活率仅为54.2%，这可能与EMS生理损伤、试验群体大小、突变性状调控的复杂性等因素有一定的关系。

在田小霞等的研究中发现，在受到盐胁迫时，材料细胞会通过积累大量的可溶性蛋白，增加SOD、POD活性等一系列的生理生化反应来适应逆境[18-19]，本试验也得到了与之相似的研究结果。EMS是一种常见的烷化剂之一，其分子具有多个能被转移的活性烷基，可转移到电子云密度较高的分子上，置换碱基中的H原子[20]。EMS诱变使旱柳DNA分子上产生较多的点突变，盐胁迫后变异体与对照组生理生化指标呈现出明显的差异，同处理条件下，SOD、POD活性和可溶性蛋白含量最多，分别比对照提高了5.1倍、9.2倍和5.2倍，对照组培养30 d时MDA达到最大值，在相同处理条件下是诱变组的1.42倍。综合各生理指标，说明盐胁迫对旱柳愈伤组织变异体的损伤较小。

本研究只针对EMS诱变处理的浓度和时间组合对旱柳愈伤组织的生长和耐盐性生理指标做了研究，初步选择出耐盐性良好的旱柳愈伤组织变异体，为日后强耐盐柳树突变植株的培育提供材料。但是诱变后如何对再生植株进行鉴定分析，如何筛选具有目的性状并可以稳定遗传的变异植株，以及深入开展旱柳强耐盐突变体库基因突变位点分布和诱变机制，还需要进一步研究。

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