芳香烃受体AhR在甲状腺癌中的表达及其诊断价值*

肖红梅

遵义医学院附属医院肿瘤科(贵州遵义 563000)

甲状腺癌是头颈部常见的恶性肿瘤，起源于甲状腺上皮细胞。近年来，甲状腺癌的发病率持续增加[1]，而甲状腺癌的治疗目前主要还是以外科手术为主，放疗、靶向治疗以及术后内分泌治疗为辅[2-3]。临床实践中，手术并发症是制约甲状腺癌治疗的一个重要因素，主要有术后出血、手术引起的喉上、喉返神经损伤、甲状旁腺功能衰退、感染等等[4-6]。临床研究中发现提高甲状腺癌的诊断水平，特别是对于甲状腺癌不同组织、不同分子类型的分析对于甲状腺癌的预后发挥重要的作用[7-9]。肿瘤标志物是在肿瘤的诊断和预后中都发挥重要的作用，甲状腺癌的临床诊断标志物有甲状腺球蛋白、癌胚抗原以及降钙素等，然而他们都存在特异性差的问题[10-12]，因此开发新的甲状腺癌诊断标志物具有较大的临床意义。而芳香烃受体(AhR)是一个配体激活的转录因子，在细胞的生长、分化、凋亡、免疫等生理活动中发挥功能，特别是在调控药物代谢方面发挥至关重要的功能[13-18]，而AhR在甲状腺癌中的表达及作为甲状腺癌肿瘤标志物未见相关的报道。本研究于2016年9月至2019年6月开展AhR基因在甲状腺癌中的研究，分析其表达水平，并探索其作为甲状腺癌诊断标志物的能力。

1 材料与方法

1.1 标本来源 48例甲状腺标本采集于遵义医学院附属医院外科手术中，患者入院前未接受其他治疗手段。纳入标准：于遵义医学院附属医院行初次单侧腺叶切除术或双侧全切除术及颈部淋巴结清扫术的甲状腺癌患者，术前经彩色超声及细针穿刺细胞学检查诊断为甲状腺癌，并且术后组织病理确诊。排除标准：复发性或转移性甲状腺癌不纳入本研究中，术后病理证实为甲状腺良性结节也不纳入本研究中。其中男27例，女21例，30周岁以下的患者有3例，30～40周岁之间的患者有25例，40～50周岁的患者有13例，50周岁以上的患者有7例。患者中存在淋巴结转移有23例，未转移患者25例。肿瘤患者术后病理的病理分期(pTNM)分期Ⅰ期患者9例，Ⅱ期患者5例，Ⅲ期患者31例，Ⅳ期患者3例，pTNM分期标准根据AJCC第8版进行[19]。

1.2 材料与试剂 总RNA提取试剂TriZol，第一链cDNA反转录试剂盒，SYBR荧光定量试剂盒，引物序列由上海生工生物技术有限公司合成，序列如下：AhR的上游引物为5′-ACAT CACC TACG CCAG TCG-3′，AhR下游引物为5′-CGC TTGG AAGG ATTT GACT TGA-3′；内参采用glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)，上游序列为5′-GGAG CGAG ATCC CTCC AAAA T-3′，下游序列为5′-GGCT GTTG TCAT ACTT CTCA TGG-3′。

1.3 方法

1.3.1 标本的处理 甲状腺癌标本采集于外科切除手术中，标本用于研究获得患者知情同意。标本采集完成后立即保存于超低温冰箱中，组织的后续处理是采用机械研磨，充分裂解组织样品。裂解的标本组织加入总RNA提取试剂，室温下反应10 min，然后加入同体积氯仿，充分振荡后室温下静置10 min，12 000 r/min下离心10 min，吸取上清转移到干净的离心管中，加入同体积的异丙醇溶液，充分振荡后静置5 min，12 000 r/min离心10 min，弃去上清，离心管底部的白色沉淀即为总RNA，75%乙醇洗涤2次后，充分干燥挥发乙醇。加入无核酸酶的去离子水，溶解RNA沉淀。得到的RNA测定浓度后，采用反转录试剂盒获得cDNA样品，用于后续荧光定量PCR的分析。

1.3.2 荧光定量PCR 按照试剂说明书，按以下配方配制反应：SYBR预混试剂10 μL，正反向引物各0.5 μL，标本cDNA样品加入量为100 ng，去离子水补齐至20 μL。冰上配制反应体系，并注意避光。配制完成后混匀后离心，采用StepOne仪器进行反应。设置的程序为，预变性2 min，95℃反应10 s，60℃反应30 s。循环设置为40个，程序后加引物溶解曲线程序，根据峰型来评价引物特异性，荧光定量PCR分析方法采用2-ΔCT法。

1.3.3 生物信息学分析 分析TCGA甲状腺癌标本数据库，TCGA甲状腺癌表达谱数据库采用生物芯片测序，基因的表达水平采用log(TPM+1)来进行表示，TPM即为transcripts per million，计算的是某个转录本在一个样品测到的所有转录本中所占的比例，说明基因在样本中的相对表达水平。运用GEPIA在线分析工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)[20-21]，输入分析基因名称AhR，数据库选择甲状腺癌数据库，其中有512例甲状腺癌组织标本和59例癌旁正常标本。癌组织标本中有BRAF样癌组织275例，RAS样癌组织标本118例。而根据甲状腺癌的病理分型，512例甲状腺癌组织中有358例经典型，36例高细胞型和102例滤泡型。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件，计数资料采用2检验，计量资料采用表示，组间差异的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析AhR基因在甲状腺癌中的表达 分析TCGA甲状腺癌数据库中癌组织和正常组织中AhR的表达水平发现，AhR基因在癌组织中的表达显著高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.001)，见表1。进一步的根据甲状腺癌的分子分型，分析AhR基因在BRAF样甲状腺癌和RAS样甲状腺癌中的差异性表达，发现BRAF样甲状腺癌癌组织中AhR基因的表达显著高于RAS样甲状腺癌肿瘤组织，而且RAS样甲状腺癌肿瘤组织的AhR表达水平低于正常组织，差异有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 AhR在TCGA甲状腺癌数据库中肿瘤组织和正常组织的表达水平

*与正常组织比较P<0.001；△与BRAF样肿瘤组织比较P<0.001

2.2 AhR基因在甲状腺癌不同组织类型中的表达 AhR在36例高细胞亚型甲状腺癌中的表达最高，高于经典型和滤泡型甲状腺癌，见表2。

表2 不同组织类型甲状腺癌中AhR的表达水平

*与经典型比较P<0.001

2.3 RT-PCR检测AhR基因在48例甲状腺癌肿瘤组织和正常组织中的差异 48例甲状腺癌外科手术收集的肿瘤组织和癌旁组织中AhR的表达水平存在显著的差异，AhR基因在肿瘤组织中高表达，差异有统计学意义(P<0.001)，见表3。其中肿瘤组织和正常组织(T/N)比值>5的有18例(37.5%)患者，而1.51.5)的患者例数为39例，约81.3%。

表3 RT-PCR分析48例甲状腺癌肿瘤组织和正常组织中AhR的表达差异

*与正常组织比较P<0.001

2.4 ROC分析AhR作为甲状腺癌诊断标志物的潜力 ROC分析48例甲状腺癌标本显示，AhR作为甲状腺癌诊断标志物，其线下面积(AUC)高达0.78(P<0.001)，约登指数最大时定义为最佳诊断值，此时AhR基因的相对表达值为0.102 4， AhR作为甲状腺癌分子诊断标志物的敏感度为70.83%，而特异度为83.33%。见图1。

2.5 早期甲状腺癌肿瘤组织中AhR的表达及ROC分析 48例甲状腺癌患者中Ⅰ期9例和Ⅱ期患者5例纳入早期甲状腺癌分析中，发现14例早期甲状腺癌患者肿瘤组织中AhR的表达水平显著高于对应的正常组织 (P<0.001)。而ROC曲线分析的结果显示AhR在14例早期甲状腺癌患者中的ROC线下面积为0.85(P<0.001)，约登指数最大时的敏感度为78.57%，特异度为92.86%，此时AhR基因表达水平的截断值为0.102，见表4和图2。

图1 ROC分析48例甲状腺癌患者中AhR的诊断价值

项目样本量AhR基因中位数表达水平P值肿瘤Ⅰ和Ⅱ期患者<0.000 1 肿瘤组织140.18 正常组织140.07无淋巴结转移患者<0.000 1 肿瘤组织250.12 正常组织250.03

图2 早期甲状腺癌中AhR的表达及ROC分析

2.6 淋巴结未转移的甲状腺癌患者中AhR表达水平及ROC分析 48例甲状腺癌患者中23例患者术后病理显示存在淋巴结转移，而25例患者未发现淋巴结转移。AhR基因在24例淋巴结未转移的甲状腺癌患者肿瘤组织中均高于正常组织，仅有1例患者肿瘤组织中AhR的表达低于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。而ROC的分析表明AhR作为淋巴结未转移的甲状腺癌患者诊断标志物线下诊断面积为0.75，最大约登指数时的敏感度为88%，而特异度为68%，此时AhR基因表达水平的截断值为0.097，见图3。

图3 淋巴结未转移甲状腺癌患者中AhR表达及ROC分析

3 讨论

近年来，甲状腺癌已经成为头颈部肿瘤最常见的恶性肿瘤，甲状腺癌的预后较其他类型恶性肿瘤较好，得益于其较全面的肿瘤分型，为甲状腺癌的治疗提供丰富的参考。而临床中甲状腺癌的诊断是一大难点，对于甲状腺癌和甲状腺结节，常规的CT和MRI很难区分，而甲状腺癌的肿瘤标志物，如甲状腺球蛋白、癌胚抗原以及降钙素等，特异性较差，因此开发新的甲状腺癌诊断标志物、特别是发现对于早期甲状腺癌的诊断标志物具有重要的意义。

AhR一种表达与细胞质内的转录因子，在细胞生长、分化以及药物代谢方面发挥重要的功能。据报道，AhR介导多环芳烃、多氯联苯等致癌物的促癌通路[22]，近年来也发现AhR在乳腺癌等肿瘤中也介导细胞周期的调控。本研究首次探究AhR在甲状腺癌的表达，并探索其作为甲状腺癌诊断标志物的潜力。基于生物信息学的分析，我们发现AhR受体在甲状腺癌的肿瘤组织中高表达，并且AhR的高表达存在组织特异性，AhR在BRAF样甲状腺癌中的表达显著高于RAS样甲状腺癌(表1)，而BRAF样甲状腺癌和RAS样甲状腺癌在很多方面存在显著的差异[23]，说明AhR可能在甲状腺癌不同组织类型中发挥不同的功能。肿瘤的组织类型是影响患者预后最重要的因素之一[24]，本研究分析了AhR在甲状腺癌经典型、高细胞亚型和滤泡型中的表达，而AhR在高细胞亚型甲状腺癌中表达高于经典型和滤泡型(表2)，而大量的临床研究也发现高细胞亚型甲状腺癌的预后较经典型和滤泡型要差很多[25]，因此从这一方面来看，AhR的表达与甲状腺癌的组织类型也存在紧密的联系。不仅如此我们也利用收集的甲状腺癌临床标本进一步进行了验证，发现AhR在甲状腺癌肿瘤组织中显著高表达。

AhR在甲状腺癌肿瘤组织中高表达，那么其有可能作为甲状腺癌的肿瘤标志物，辅助甲状腺癌的诊断吗？因此我们进一步进行了ROC分析，发现AhR作为甲状腺癌诊断标志物，其线下面积为0.78，约登指数最大值时认为具有是最佳截断点，其敏感度为70.83%，特异度为83.33%(图1)。而考虑甲状腺癌早期诊断在甲状腺癌的治疗中更有应用价值，我们分析了14例处于Ⅰ期和Ⅱ期的甲状腺癌患者以及25例淋巴结未发现转移患者的AhR水平。结果表明，即使是早期甲状腺癌患者和淋巴结未发现转移灶的患者，其肿瘤组织中AhR的水平也显著增加(表4)，而ROC的结果也显示其诊断线下面积分别为0.85和0.75(图2、3)，与FNA细胞学检查一样，都具有较高的敏感性和特异性[26]。

综上所述，本研究发现AhR在甲状腺癌肿瘤组织中的表达显著增加，并且其高表达可作为甲状腺癌的诊断标志物，具有较高的敏感性和特异性，即使在早期甲状腺癌患者以及淋巴结未出现转移的患者中仍然具有很高的诊断价值，在后续的研究中， AhR在不同组织类型甲状腺癌的诊断能力值得进一步的探究，为甲状腺癌的诊断，特别是早期诊断和不同组织类型甲状腺癌的诊断提供临床参考。