低剂量他克莫司导致大鼠糖耐量异常机制的初步探讨

高雅莉，陈亚，李代清

移植后糖尿病（PTDM）是肾移植患者的常见并发症［1］。移植后糖尿病的危险因素包括年龄、家族史、肥胖、免疫抑制剂的使用等［2］。他克莫司作为免疫抑制剂中的一线用药［3］，虽能提升患者及移植物的存活率，但同时也增加了移植后糖尿病的发生风险。Porrini等［4］报告PTDM的患病率在术后3、12、24和36个月分别为27%、21%、21%和30%。如果他克莫司损伤胰岛的潜在机制被阐明，就可以预防性地对可能发生移植后糖尿病的高危患者给予胰岛保护措施，减少移植后糖尿病发病率。既往报道中发现，长期、大剂量在动物体内使用他克莫司，可导致胰腺组织的氧化应激、β 细胞凋亡、胰岛素分泌不足，最终导致糖尿病的发生［5-6］。但实际上临床中他克莫司使用剂量远低于既往报道剂量（1.5 mg/kg），为进一步探索更接近于移植后患者他克莫司使用剂量对胰岛功能的影响，本研究关注小剂量、短期使用他克莫司对大鼠血糖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性SD 大鼠20 只，体质量300～350 g，购自北京华阜康公司。动物饲养在标准环境中，自由获取水和食物。他克莫司购自MCE公司，用橄榄油稀释成所需浓度。血糖仪（Accu-Check，Roche Diagnostics）和配套血糖试纸购自罗氏公司。大鼠胰岛素酶联免疫吸附法（ELISA）测定试剂盒购自Mercodia 公司。Insulin 抗体购自Servicebio 公司。通用二步法检测试剂盒、DAB染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。苏木素染液购自索莱宝公司。E.Z.N.A.总RNA 分离试剂盒购于美国OMEGA 公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；定量PCR试剂盒（FAST SYBR Mixture）购自生工生物工程（上海）有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 在适应环境1周后，将20只大鼠随机分成低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组4组，实验组分别皮下注射0.1、0.5、1.0 mg/kg他克莫司，每日1次，连续注射1周，对照组皮下注射等剂量橄榄油。

1.2.2 体质量监测 隔天在同一时段给动物称质量，记录实验期间各组动物体质量变化情况。

1.2.3 腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT） 动物禁食过夜，采取尾尖扎血的方式测量空腹血糖，然后每只鼠腹腔注射50%葡萄糖（2 g/kg），分别以同种方法测量30、60、120 min的血糖值。由IPGTT 结果，采用梯形估算法［7］根据IPGTT 结果计算曲线下面积。

1.2.4 胰岛素抵抗情况评估 在给药1周后，尾尖取血测量空腹血糖（FBG），大鼠麻醉后股动脉取血，ELISA试剂盒检测空腹胰岛素（FINS）含量并计算稳态模型下胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。HOMA-IR=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）/22.5。

1.2.5 胰尾部取材 大鼠过夜禁食，麻醉后四肢固定，75%乙醇皮肤消毒，沿正中切口切开，快速剪取胰尾部，置于4%多聚甲醛中固定。48 h 后，组织经过不同浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋等步骤后，切片至5 μm备用。

1.2.6 免疫组化染色 用insulin 染色评估每个胰岛中胰岛素阳性区域。经过脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复、内源性过氧化氢消除、血清封闭后，切片用insulin（1∶500）抗体4 ℃过夜孵育，然后滴加增强复合物和二抗，根据DAB 染色程度判定胰岛素蛋白的表达情况。在400放大倍数下每组随机观察15个胰岛，通过测量胰岛素染色阳性区域占总胰岛面积的百分比来量化β细胞数量。

1.2.7 大鼠胰岛的摘取 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg，麻醉后取仰卧位将其四肢固定于手术台上。75%乙醇消毒皮肤后，取正中切口，暴露腹腔脏器。找到胆总管，分别在十二指肠乳头端及近肝门处予1号丝线结扎。股动脉放血处死大鼠，于胆总管近肝门处0.45 mm头皮针穿刺，向胰腺内灌注浓度为1 g/L 胶原酶Ⅴ约10 mL，至胰腺完全膨胀，迅速分离胰腺，置于50 mL 离心管中，37 ℃水浴20～25 min 后，预冷Hank's液约35～40 mL终止消化，用力摇晃离心管，使胰腺组织成泥沙状，静置5 min（冰浴），待其分层后弃上层液体，加入35～40 mL 预冷Hank's 液，洗涤2 次。混匀后取2～3 mL 消化物于平皿中，体式镜下手工挑拣胰岛，置于装有Hank's液的1.5 mL EP管中备用。

1.2.8 qPCR检测胰岛素分泌相关基因的表达 将收集的胰岛按E.Z.N.A.总RNA分离试剂盒说明书萃取总RNA，逆转录试剂盒逆转录成cDNA。逆转录条件：25 ℃ 5 min，42 ℃1 h，72 ℃5 min。定量PCR试剂盒扩增，扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃扩增30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40 个循环，引物序列见表1。根据qPCR 得出的荧光曲线的Ct 值，以β-actin为内参，用2-ΔΔCt计算结果，ΔCt=目的基因Ct 值-β-actin Ct值，ΔΔCt=低剂量组ΔCt值-对照组ΔCt值。实验结果以对照组的倍数表示。

Tab.1 Sequences of primers for qPCR表1 定量PCR引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示。他克莫司不同浓度干预组与对照组相比较用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。组内多个时间点间比较采用重复测量资料的方差分析。小剂量干预组与对照组间胰岛素分泌相关基因表达水平比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组间体质量变化 实验期间，对照组体质量逐渐增加，他克莫司小剂量组体质量无明显变化，中、高剂量组呈下降趋势。与对照组相比，不同剂量他克莫司组均出现体质量下降，且呈剂量依赖性。见表2。

2.2 腹腔内注射葡萄糖耐量试验 IPGTT 结果显示，120 min 内4 组血糖均呈现先升高后降低的变化，均于30 min达到峰值。与对照组相比，不同剂量他克莫司组均出现糖耐量异常，中、高剂量组血糖水平和曲线下面积均较低剂量组升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性。见表3、图1。

Fig.1 Comparison of the area under the curve of glucose图1 葡萄糖曲线下面积比较

2.3 胰岛素抵抗水平比较 4 组间FBG、FINS 和HOMA-IR差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

2.4 免疫组化染色结果 低剂量组与对照组胰岛β细胞形态清晰完整，染色面积无明显变化；中、高剂量组胰岛β细胞排列位置紊乱，内部出现空泡，胰岛素阳性染色面积较低剂量组与对照组减少（P＜0.05），见图2。

Tab.2 Changes of the body mass changes during the experiments in the four groups表2 4组实验期间体质量变化 （g，n=5，±s）

Tab.2 Changes of the body mass changes during the experiments in the four groups表2 4组实验期间体质量变化 （g，n=5，±s）

＊＊P＜0.01；同一时间不同组间比较，a与对照组比较，b与低剂量组比较，c与中剂量组比较，P＜0.05；组内不同时间点比较，A与day 0 比较，B与day 2比较，C与day 4比较，P＜0.05

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F day 0 331.40±3.71 334.20±4.09 335.40±3.21 337.40±4.67 2.01 day 2 360.40±8.26A 332.80±6.06a 331.00±4.00a 323.40±4.39aA 37.35＊＊day 4 372.40±6.19AB 336.20±6.12a 324.40±5.98abA 310.60±4.67abcAB 104.63＊＊day 6 384.00±8.97ABC 340.00±5.72a 321.40±8.44abAB 299.80±5.54abcABC 119.15＊＊F 50.81＊＊1.86 6.01＊＊56.36＊＊

Tab.3 The results of intraperitoneal glucose tolerance test in the four groups表3 4组腹腔注射葡萄糖耐量试验结果 （mmol/L，n=5，±s）

Tab.3 The results of intraperitoneal glucose tolerance test in the four groups表3 4组腹腔注射葡萄糖耐量试验结果 （mmol/L，n=5，±s）

＊＊P＜0.01；同一时间不同组间比较，a与对照组比较，b与小剂量组比较，c与中剂量组比较，P＜0.05；组内不同时间点比较，A与0 min 比较，B与30 min比较，C与60 min比较，P＜0.05

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F 0 min 4.72±0.34 5.00±0.58 4.98±0.54 4.96±0.15 0.45 30 min 20.58±2.11A 23.90±2.04aA 28.16±2.33abA 28.08±1.69abA 15.81＊＊60 min 10.78±1.18AB 17.14±3.45aA 20.24±2.41abAB 23.03±1.34abAB 26.50＊＊120 min 6.08±0.29BC 7.88±1.65BC 11.10±2.53abABC 12.64±1.27abABC 16.41＊＊F 170.72＊＊78.56＊＊115.61＊＊341.84＊＊

Tab.4 Changes in FBG,FINS and HOMA-IR of four groups表4 不同组间FBG、FINS、HOMA-IR变化（n=3，±s）

Tab.4 Changes in FBG,FINS and HOMA-IR of four groups表4 不同组间FBG、FINS、HOMA-IR变化（n=3，±s）

均P＞0.05

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组F FBG（mmol/L）4.50±0.31 5.03±0.50 5.37±0.42 5.17±0.15 2.79 FINS（mIU/L）5.51±1.91 4.59±1.17 4.95±1.29 5.65±1.73 0.30 HOMA-IR 1.10±0.28 1.01±0.15 1.18±0.33 1.29±0.35 0.47

Fig.2 Comparison of the insulin staining results and percentage of insulin positive area between the four groups图2 4组胰岛素染色结果和胰岛素阳性面积比较

2.5 胰岛素分泌相关基因检测结果 qPCR结果显示，与对照组相比，低剂量组Epac、Rim2、Piccolo、Rab3a、Munck13表达量减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

Fig.3 Effects of low dose tacrolimus on gene expression of insulin secretion related protein图3 小剂量他克莫司对胰岛素分泌相关蛋白基因表达的影响

3 讨论

以往研究报道多以长期大剂量使用他克莫司导致糖耐量异常为主，并未报道过小剂量短期使用他克莫司也会出现糖耐量异常现象。本研究与既往报道相同的是，高、中剂量组均出现β 细胞数量减少，胰岛素染色阳性面积减少，胰岛素合成减少。大剂量他克莫司干预导致糖耐量异常的机制早在Heit等［8］的研究中曾报道，他克莫司通过抑制钙调神经磷酸酶/活化T 细胞核因子（Cn/NFAT）通路，抑制影响 β 细胞生长和胰岛素的合成。He 等［9］发现 Cn/NFAT 通路可调节肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖、迁移及凋亡。胰岛素由胰腺β 细胞产生，葡萄糖刺激的胰岛素分泌包括两个时相，Epac在一相分泌中占主导作用，PKA 在二相分泌中占主导作用［10］。在高糖刺激条件下，cAMP 可以通过Epac途径来促进胰岛素的胞吐［11］。此外，Epac促进胰岛素分泌可能与其和Rim2-Rab3a 形成的复合体有关［12］。Rim2 通过与囊泡相关蛋白 Rab3a 相互作用的囊泡对接，以及通过激活下游因子Munc13，导致反式 SNARE 复合物的组装，从而导致胞吐［13］。Piccolo 作为胰腺细胞胞吐作用的钙离子传感器，Piccolo与Rim2以钙离子依赖的方式形成异二聚体，在cAMP诱导的胞吐作用机制中发挥重要作用［14］。

血糖升高主要的原因可归因于胰岛素分泌减少和胰岛素抵抗，胰岛素分泌减少可由胰岛素合成减少和分泌异常导致。本实验研究结果显示不同剂量他克莫司组的HOMA-IR 与对照组无明显差异，说明在短时间内并未出现胰岛素抵抗，所以主要考虑胰岛素分泌减少的问题。低剂量组胰岛素阳性面积与对照组无明显差异，说明胰岛的合成功能无异常，故主要考虑胰岛分泌功能是否异常。摘取低剂量干预组大鼠胰岛做分泌相关蛋白的PCR 检测，结果表明，胰岛素分泌相关基因Epac、Rim2、Piccolo、Rab3a、Munck13表达减少，小剂量短期干预组胰岛素合成并无变化，主要通过胰岛素分泌障碍来致使胰岛素分泌减少、糖耐量异常。

本研究的发现在低于一般报道剂量（1.5 mg/kg）15 倍（0.1 mg/kg）的情况下，只需干预1 周的他克莫司便可造成糖耐量异常，这一发现超出了我们对他克莫司造成胰岛损伤的一般预期。他克莫司胰岛毒性是目前胰岛移植临床转归的障碍之一，如果其中的潜在机制被阐明，可以预防性地对可能发生移植后糖尿病的高危患者给予胰岛保护措施，如GLP-1等，为移植后糖尿病发生风险的降低提供新思路。