破壁处理与改进QuEChERS结合UPLC-MS/MS快速检测蔬菜中52种农药残留

徐春奎 李艳 侯莉莉 张冷思

摘要 [目的]建立一种蔬菜中52种农药残留快速前处理的液相色谱-串联质谱检测方法。[方法]52种目标农药添加至经过破壁处理的空白基质小青菜中，静置24 h后，使用乙腈超声提取，高速离心并以乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、无水硫酸镁按1∶1混合净化后上机检测。[结果]在低（25 μg/kg）、中（50 μg/kg）、高（100 μg/kg）3种添加浓度水平下，样品经破壁处理后再采用改进的QuEChERS法前处理平均回收率为60.45%～114.01%，相对标准偏差（RSD）为0.20%～12.18%。[结论]该方法更简单快速、准确高效、相对省时省力，且均符合检测要求，可用于日常蔬菜中农药残留的测定。

关键词 破壁处理;QuEChERS;农药残留;超高效液相色谱-串联质谱法;前处理

中图分类号 TS207.5+3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）22-0200-06

Abstract [Objective] The research aimed to establish a liquid chromatographytandem mass spectrometry method for the rapid pretreatment of 52 pesticide residues in vegetables.[Method]52 kinds of target pesticides were added to the blank substrate，which was treated with wallbreaking.After standing for 24 h，it was ultrasonically extracted with acetonitrile，centrifuged at high speed，and purified by 1：1 mixing with ethylenedia mineNpropylsilane （PSA） and anhydrous magnesium sulfate.[Result]Under the three levels of low，medium and high concentration，the average recovery of the sample after treatment with wallbreaking and improved QuEChERS method was 60.45%～114.01%，and the relative standard deviation （RSD） was 0.20%12.18%.[Conclusion]The method is simpler，faster，more accurate and more efficient，relatively timesaving and laborsaving，and all meet the testing requirements.It can be used for the determination of pesticide residues in daily vegetables.

Key words Wallbreaking treatment;QuEChERS; Pesticide residues;UPLCMS/MS; Pretreatment

農产品质量安全事关人民群众的身体健康，一直是社会关注的焦点和热点问题，做好农残检测工作是保障消费者买到安全放心的农产品的重要手段。在农产品质量安全日益受到重视的同时，寻求一种更加简便快速的农药残留前处理方法显得尤为重要。我国蔬菜中农药多残留检测现行有效的标准主要有NY/T 448—2001、NY/T 761—2008、GB 23200.113—2018、GB 23200.8—2016、GB/T 20769—2008等，检测方法主要有分光光度法[1]、液相色谱法[2-3]、气相色谱法[4-5]、气相色谱-串联质谱法[6-9]、液相色谱-串联质谱法[10-13]。分光光度法主要是定性分析，不能准确定量;色谱法主要参考NY/T 761—2008，由于蔬菜基质比较复杂，基质效应较强，采用色谱法容易产生假阳性，且由于不同目标物必须选择合适的检测器，很难完成多类不同结构的农药同时检测;气相色谱-串联质谱法虽然能准确定性，但检出限、灵敏度、稳定性以及定量均不够理想。因而，常见的农药残留检测大多采用液相色谱-串联质谱法。笔者以普通白菜（小青菜）为基质，样品经破壁处理后再采用改进的QuEChERS法前处理，结合超高效液相色谱-串联质谱，建立简便快速、准确检测蔬菜中52种常见农药残留的定性定量分析方法，从而为检测人员提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

液相色谱仪（安捷伦，1290）;三重四极杆质谱仪（配电喷雾离子源）（安捷伦，6460c）;超声波清洗机（宁波东芝）;旋涡混合器（艾卡公司，MS3）;离心机（赛默飞，ST16R）;振荡器（常州荣华，HY-2A）;天平（艾德姆，HCB602H）;瓶口分液器（德国普兰德）;固相萃取装置（天津恒奥，HHE-12B）;氮吹仪（北京同泰联，TTL-DCII）;破壁料理机（苏泊尔）;普通料理机（博朗）;高速匀浆机（艾卡公司，T25 D S25）。

1.2 试剂 52种农药为3-羟基克百威、阿维菌素、啶虫脒、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、嘧菌酯、甲萘威、多菌灵、克百威、氯虫苯甲酰胺、灭幼脲、氟啶脲、灭蝇胺、敌敌畏、苯醚甲环唑、除虫脲、烯酰吗啉、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（甲维盐）、氯吡脲、吡虫啉、灭多威、氧乐果、二甲戊乐灵、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、辛硫磷、咪鲜胺、霜霉威、嘧霉胺、吡唑醚菌酯、虫酰肼、噻虫嗪、矮壮素、乙硫磷、仲丁威、氟硅唑、己唑醇、地虫硫磷、扑灭威、异柳磷、甲基毒死蜱、异丙甲草胺、速灭威、久效磷、多效唑、抗蚜威、甲基嘧啶磷、吡蚜酮、喹硫磷、甲基硫菌灵，标准品溶液纯度均不低于99%，均购买于农业部环境质量监督检验测试中心（天津），用乙腈将52种农药配制成浓度为20 mg/kg的混合标准浓液（-20 ℃）保存备用。

乙腈、甲醇为色谱纯（天地），甲酸为优级纯，氯化钠为分析纯，无水硫酸镁为分析纯，石墨化碳黑和PSA （Aiglent），NH2柱（Aiglent）。

1.3 试验设计

该试验通过加标回收验证检验检测方法，思路为设3个浓度梯度，从低到高分别为25、50、100 μg/kg，每个浓度设3个平行样。

1.4 样品前处理过程

1.4.1 小青菜基质制样。同一批小青菜样品均分为2组，一组通过破壁料理机处理，制成均质试样待用，另一组通过普通料理机处理，制成均质试样待用。

1.4.2 前处理。准确称取10 g（精確到0.01 g）均匀试样于50 mL离心管中，加入约2 g无水氯化钠，准确加入10 mL的预冷乙腈（4 ℃冷藏），涡旋混匀30 s，离心管平放，水平振荡5 min，转速330 r/min，冰浴超声提取2 min（温度控制在0～4 ℃），高速冷冻离心1 min（4 ℃，8 000 r/min），上清液备用;将无水硫酸镁和PSA按1∶1比例混合均匀适量灌注注射器，且连接0.22 μm有机系滤膜，取适量上清液（约1 mL）过滤装样品瓶备用。

1.5 色谱条件

色谱柱：Agilent C18 柱 （InfinityLab Poroshell 120 EC -C18 3.0 mm×150 mm，2.7-Micron）;流 动 相：A相为0.1% （V/V）甲酸水（含5 mmol/L的乙酸铵），B相为0.1%（V/V）甲酸甲醇（含5 mmol/L的乙酸铵）;梯度洗脱程序：0～1.0 min，从80%A变为40%A，1.0～4.0 min，从40%A变为15%A，4.0～10.0 min，从15%A变为0;10.0～14.0 min保持100%B，14.0～14.1 min，从0%A变为80%A，14.1～15.0 min，保持80%A;流速0.4 mL/min;进样量1.5 μL;时间15 min;柱温30 ℃。

1.6 质谱条件

电离模式：电喷雾正离子（ESI+）;毛细管电压：40 kV;离子源温度350 ℃;干燥气流速10 L/min，雾化器压力310.26 kPa;扫描方式：正离子;采集方式：动态多反应监测扫描模式（Dynamic MRM）。质谱采集参数见表1以及52种农药标准样品的MRM总离子流色谱图见图1。

2 结果与分析

2.1 样品经破壁处理后再采用改进的QuEChERS法前处理效果评价

QuEChERS法自2003年由Anastassiades等[14]提出以来，广泛地应用于农兽药残留检测分析[15-17]。因农药、蔬菜品种均较多，很难真正地寻找一种普适的农药残留检测的QuEChERS法。该试验采用空白小青菜基质经过破壁处理和普通处理制样进行对比，并通过加标回收试验的方法，展开对改进的QuEChERS法前处理效果进行评价，回收率和RSD见表2。从表2可以看出，经加标回收试验，3个浓度梯度的加标回收率，对阿维菌素、啶虫脒、涕灭威、涕灭威亚砜、多菌灵、克百威、氯虫苯甲酰胺、氟啶脲、烯酰吗啉、甲维盐、吡虫啉、氧乐果、甲拌磷亚砜、霜霉威、嘧霉胺、噻虫嗪、乙硫磷、速灭威、抗蚜威、吡蚜酮20种农药来说，破壁处理和普通处理制样效果差不多;对3-羟基克百威、涕灭威砜、甲萘威、苯醚甲环唑、氯吡脲、灭多威、二甲戊灵、甲拌磷砜、辛硫磷、吡唑嘧菌酯、矮壮素、氟硅唑、扑灭威、异柳磷、甲基毒死蜱、异丙甲草胺、久效磷、甲基嘧啶磷18种农药来说，破壁处理比普通处理组效果较好;对嘧菌酯、灭幼脲、灭蝇胺、敌敌畏、除虫脲、甲拌磷、咪鲜胺、虫酰肼、仲丁威、己唑醇、地虫硫磷、多效唑、喹硫磷、甲基硫菌灵14种农药来说，破壁处理比普通处理组效果好。

在普通处理制样后采用该试验改进的QuEChERS前处理，灭蝇胺和矮壮素在低、中、高3种浓度水平的回收率均低于60%，分别为35%、50%左右，敌敌畏在低浓度水平以及甲拌磷、甲基毒死蜱、甲基硫菌灵在高浓度水平时回收率均低于60%。从整体上来说，2种处理组相比，破壁处理组加标回收率水平较好。主要原因可能是农药残留于蔬菜，不仅存在于蔬菜表面，更有可能渗入组织细胞内，提取时不容易释放

出来，经破壁处理后，破坏了蔬菜样品的细胞壁结构，有助于细胞内容物溶出，这样更有利于后续乙腈以及超声提取出农药残留，提高了农药残留提取效率。同时制样时样品经过破壁处理，后续提取步骤则无需再经过匀浆操作，减少了检测人员接触有机溶剂的机会;提取过程中有机溶剂经过预冷处理，超声温度控制在0～4 ℃，这样有利于热不稳定农药残留的提取（主要是有机磷类和氨基甲酸酯类农药）。

2.2 样品净化剂的选择

样品前处理过程中基质干扰物去除情况，直接影响检测效果以及仪器污染情况。因此，样品前处理过程中对基质的净化选择显得尤为重要。该试验选择乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、无水硫酸镁、石墨碳黑（GCB）三者按不同比例混合净化基质，但GCB对多菌灵、氯虫苯甲酰胺、灭幼脲、氟啶脲、除虫脲、甲维盐、氯吡脲、吡蚜酮、吡唑醚菌酯有吸附，导致这9种农药回收率很低，最终以PSA∶无水硫酸镁混合比例为1∶1净化效果较好，无水硫酸镁主要作为除水剂来除去样品基质中的水分，PSA是去除碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类和色素等杂质干扰。

2.3 流动相的选择/净化方式的选择

试验选择水和甲醇作为流动相，并比较添加5 mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸，结果发现水和甲醇均添加含5 mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸时52种农药峰形更好、响应信号更强，离子化效果更好（图1）。

2.4 线性关系和定量限

52种农药标准曲线在6.25～200.00 μg/kg线性关系良好，线性相关系数（r2）均大于0.99（表2），试验分别以3倍信噪比和10倍信噪比考察了改进QuEChERS法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），52种农药的LOQ为3.0～6.0 μg/kg （表2），结果表明该方法满足农药残留实际检测的要求。

2.5 回收率和精确度试验 该试验采用普通白菜（小青菜）作为样品基质，每个样品进行3个水平的加标回收试验，加标水平分别为25、50、100 μg/kg，每个浓度梯度设3个平行试验，按上述改进的QuEChERS法进行前处理，上液質检测分析，采用外标法进行定量分析。小青菜基质在上述3种水平的回收率为60.45%～114.01%，RSD为0.20%～12.18%（表3），说明该方法的回收率和精密度均符合农药残留相关检测技术的要求。

2.6 实际样品检测 用该研究改进的QuEChERS方法对抽取的60份蔬菜样品进行检测，样品品种覆盖黄瓜、土豆、长豇豆、萝卜、番茄、辣椒、西葫芦、普通白菜、芹菜、茼蒿、茎用莴苣、藕、花椰菜、茄子14个品种，同时样品经破壁处理并采用GB/T 20769—2008方法[18]进行检测对比，结果发现（表4），2种检测方法结果相似，均检出农药10种，超标农药1个（啶虫脒），且数值接近（检测数值超过线性范围时，采用稀释相同倍数后再检测），说明该方法符合相关检测技术的要求。

3 结论

该方法与GB/T 20769—2008相比，对QuEChERS前处理方法进行改进，样品经破壁处理取代常规普通料理机制样，用超声提取代替高速匀浆，并结合超高效液相色谱-串联质谱建立了常见52种农药的定性定量检测方法。该方法操作更简便快速，节省提取溶液、时间和人力，更适合批量处理，有助于检测机构准确检测农药定性定量分析，并为日常监控提供依据。

参考文献

[1] 汤彤.速测卡法与酶抑制率法快速检测蔬菜中农药残留的对比研究[J].安徽农业科学，2017，45（1）：102-104.

[2] 王敏，李广益，宋丰江，等.高效液相色谱法测定蔬菜中氨基甲酸酯类农药[J].食品研究与开发，2018，39（1）：122-125.

[3] 李永新，孙成均，赵剑虹，等.高效液相色谱法同时测定蔬菜水果中的12种农药残留[J].色谱，2006，24（3）：251-255.

[4] 林泽鹏，许少美，林晨，等.气相色谱法对果蔬中氧乐果测定及结果分析[J].食品工业，2018，39（10）：310-312.

[5] 范力欣，李红艳，钱训.气相色谱法快速测定农药产品中7种高毒有机磷类农药[J].现代农药，2017，16（3）：21-23，26.

[6] 刘苗，甘平胜，朱惠扬，等.全自动固相萃取-气相色谱-三重四级杆质谱法检测蔬菜中23种农药残留[J].中国食品卫生杂志，2016，28（4）：471-476.

[7] 李蓉，卢俊文，杨芳，等.基质固相分散萃取-气相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中195种农药残留[J].食品科学，2014，35（24）：301-307.

[8] 马智玲，赵文，李凌云，等.气相色谱-三重四极杆串联质谱法快速测定蔬菜水果中129种农药的残留量[J].色谱，2013，31（3）：228-239.

[9] 范玉兰，王星梅，薛珺，等.气相色谱-负化学离子化-质谱法同时分析果蔬中9种有机磷农药残留[J].食品科学，2012，33（18）：198-201.

[10] 刘建国，孙慧，程昕，等.高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中多效唑等5种农药的分析方法[J].农药，2012，51（5）：358-359.

[11] 李娟，孙程鹏，侯颖，等.超高效液相色谱–电喷雾串联质谱测定蔬菜水果中27种常见农药残留[J].现代农药，2011，10（3）：31-35，38.

[12] 张维一，张井，高晴盈，等.超高效液相色谱串联质谱测定蔬菜中23种植物生长调节剂残留[J].西北农业学报，2019，28（2）：260-266.

[13] 花锦，陈勇，王静慧，等.分散固相萃取-液相色谱串联质谱法检测蔬菜及水果中14种不易气化的农药残留[J].农产品加工，2013（6）：75-77.

[14] ANASTASSIADES M，LEHOTAY S J，STAJNBAHER D，et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and“dispersive solidphase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J].J AOAC Int，2003，86（2）：412-431.

[15] 林涛，邵金良，刘兴勇，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中41种农药残留[J].色谱，2015，33（3）：235-241.

[16] 王连珠，周昱，陈泳，等.QuEChERS样品前处理-液相色谱-串联质谱法测 定蔬菜中66种有机磷农药残留量方法评估[J].色谱，2012，30（2）：146-153.

[17] 方从容，高洁，王雨昕，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中125种兽药残留[J].色谱，2018，36（11）：1119-1131.

[18] 庞国芳，李岩，范春林，等水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法：GB/T 20769—2008[S].北京：中国标准出版社，2009.