抗癌Ⅰ号方对人肝癌耐5-Fu细胞株BEL-7402/5-Fu细胞耐药性的逆转作用研究

高卓维,黄华聪,潘斯敏,林清,梁澄照,符路娣

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤，具有起病隐匿，入侵快，预后差，死亡率高的特点[1]。目前对于不能手术切除的患者的姑息治疗方法，如化疗和放疗，均有严重的不良反应和不同程度的耐药性[2]。临床实践表明肝癌细胞对化学治疗药物的敏感性低于许多其他癌症，常出现多重耐药(Multi-drug resistance, MDR)，其特点是肿瘤细胞的耐药性不仅针对特定药物，而是包括其它具有不同结构和作用机制的药物[3]。抗癌Ⅰ号方为广州中医药大学顺德医院治疗肿瘤的院内制剂，具有益气养阴、化瘀解毒的功效。临床上初步发现该方对肝癌患者增强机体免疫功能、与化疗合用协同增效及改善提高生存质量等多方面有一定的作用。本研究将在体外实验探讨抗癌Ⅰ号方对耐药肝癌细胞的逆转作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠购买自广东省医学实验动物中心(动物许可证号：SCXK粤2018-0002)。于广州中医药大学动物实验中心SPF级动物房饲养，提供清洁的饲料、饮用水以及昼夜各12 h的规律光照。动物实验通过广州中医药大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 实验药物

实验所用抗癌Ⅰ号方(主要成分：灵芝、铁皮石斛、白花蛇舌草、藤梨根，辅料为蜂蜜)由广州中医药大学顺德医院药剂科供。P-gp和β-actin的抗体购自美国CST公司。BCA蛋白定量试剂盒、蛋白酶与磷酸酶抑制剂、RIPA细胞裂解液购买自碧云天生物科技有限公司。PVDF膜、ECL发光液购买自Millipore公司。MTT购买自美国SIGMA公司。

1.3 实验器材

BIO-RAD电泳仪、蛋白转印系统购买自美国伯乐太平洋有限公司，曝光机为KODAK 全光谱多功能活体成像系统、酶标仪购买自美国SIGMA公司，MICROMAX高速离心机购买自赛默飞世尔科技公司。

1.4 细胞培养

人肝癌细胞株BEL-7402和人肝癌耐5-Fu(5-氟尿嘧啶)细胞株BEL-7402/5-Fu购自南京凯基生物公司。BEL-7402/5-Fu 用Gibco RPMI1640完全培养基，并含5-Fu的培养液中维持其耐药性，于37 ℃、5% CO2环境中培养。BEL-7402/5-Fu细胞株具有MDR, 可能与细胞内胸苷酸合酶和ABC转运蛋白等机制相关, 是研究MDR逆转剂的良好模型, 故选择该细胞株为研究模型。

1.5 含药血清制备

Wistar大鼠30只按2∶1的比例随机分为实验组与正常组，根据大鼠体重按1 mL/100 g分别进行灌胃，实验组给予抗癌Ⅰ号方，正常对照组给予生理盐水灌胃，连续灌胃30 d。最后1次灌胃2 h后，10%水合氯醛麻醉, 心脏采血，离心分离血清。将每组大鼠血清分别混合、72 ℃灭活30 min、除菌过滤后置4 ℃冰箱保存备用。

1.6 MTT法检测抗癌Ⅰ号方对BEL7402/5-Fu细胞活力的影响

通过MTT法检测5-Fu和抗癌Ⅰ号方含药血清对BEL7402/5-Fu细胞活力的影响。将收集的细胞(5×103个/mL)加入在96孔板中，并加入不同浓度的5-Fu和抗癌Ⅰ号方含药血清培养24 h或48 h。然后弃培养基，加入10 μL MTT溶液(0.5 mg/mL，PBS溶解)到每个孔中。 在37 ℃孵育4 h后，弃MTT加入200 μL DMSO，避光孵育10 min后通过酶标仪在490 nm波长测量OD值。

1.7 流式细胞术检测细胞罗丹明123含量

化学治疗药物从肿瘤细胞流入周围组织与P-gp有关。罗丹明-123是一种成熟的P-gp底物。因此，P-gp的药物泵的活性可通过罗丹明123在细胞内积聚的程度来测量[4]。为了测试抗癌Ⅰ号方对P-gp泵的能力，将每孔1×106个BEL7402/5-Fu细胞接种到6孔板中，在37 ℃和5% CO2下孵育24 h。将5-Fu和抗癌Ⅰ号方加入到孔中继续培养48 h。然后加入5 μg/mL罗丹明-123。37 ℃孵育30 min后，将细胞置于冰上终止反应。然后用遇冷的PBS洗涤两次并收集细胞。然后通过FACSCalibur分析样品。激发波长和发射波长分别为488 nm和530 nm。

1.8 qPCR检测肝癌细胞中MDR1、β-actin mRNA表达水平

实验分组：空白组(BEL7402细胞)、对照组(BEL7402/5-Fu细胞)和抗癌Ⅰ号方组(BEL7402/5-Fu细胞+10%抗癌Ⅰ号方含药血清)。细胞经上述处理24 h后，用TRIzol提取各组细胞的总RNA并按试剂盒说明逆转录成cDNA(1～2 μg)，用各个基因的特异性引物(见表1)进行PCR扩增。使用相对定量方法比较转录物量，其中将检测到的mRNA的量标准化为内源对照(β-actin)。

表1MDR1、β-actin引物碱基序列

1.9 Western blot检测P-gp表达

在许多体外抗药性细胞系中，可以观察到P-gp蛋白的过表达，P-gp高表达并被认为是MDR表型之一[5]。我们采用Western blot检测抗癌Ⅰ号方对结肠癌细胞P-gp表达的影响。实验分组：空白组(BEL7402细胞)、对照组(BEL7402/5-Fu细胞)和抗癌Ⅰ号方组(BEL7402/5-Fu细胞+10%抗癌Ⅰ号方含药血清)。经过不同处理的细胞用PBS洗涤两次，然后收集并用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂RIPA细胞裂解缓冲液提取细胞总蛋白。裂解后离心，12 000 rpm，15 min。按蛋白定量试剂盒说明进行蛋白定量。用12%或8%SDS-PAGE凝胶分离蛋白质样品，然后转移到PVDF膜上。转膜结束后，5% BSA封闭两小时，接着一抗(P-gp、GAPDH，稀释浓度1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST清洗三遍，然后在37 ℃下将与相应的二抗孵育1 h，TBST清洗两遍后用Kodak扫描系统检测蛋白条带, 并使用ImageJ软件分析条带蛋白浓度。

1.10 统计方法

2 结果

2.1 抗癌Ⅰ号方降低耐药肝癌细胞活力

为了评估抗癌Ⅰ号方对耐药肝癌细胞活力的影响，我们采用MTT进行检测。结果(图1)显示，与BEL7402细胞相比，在BEL7402/5-Fu细胞活力显著增高；然而，在用抗癌Ⅰ号方含药血清处理48 h后，BEL7402/5-Fu细胞活力显著低。

图1肝癌细胞活力 与BEL7402/5-Fu细胞比较，*P<0.05

2.2 抗癌Ⅰ号方增强耐药肝癌细胞内罗丹明-123积累

流式细胞仪检测结果(图2)表明，BEL7402细胞的罗丹明-123积累量高于BEL7402/5-Fu细胞的3.16倍；与BEL7402/5-Fu细胞的对照组相比，10%抗癌Ⅰ号方含药血清使罗丹明-123的积累增加2.08倍。结果提示，抗癌Ⅰ号方抑制P-gp的细胞外排功能，以增加罗丹明-123的细胞内积累，从而降低细胞耐性。

图2肝癌细胞罗丹明123含量 与BEL7402/5-Fu细胞比较，**P<0.01

2.3 抗癌Ⅰ号方对耐药基因MDR1表达的抑制作用

P-gp由基因MDR1编码，我们通过RT-PCR分析以评估抗癌Ⅰ号方对MDR1基因表达的调节。结果(图3)显示，对照组MDR1 mRNA显着增加；然而，用抗癌Ⅰ号方含药血清处理BEL7402/5-Fu细胞48 h后，MDR1 mRNA的表达显著降低，甚至低于非抗性BEL7402细胞组。

图3肝癌细胞内MDR1 mRNA表达水平 与BEL7402/5-Fu细胞比较，**P<0.01

2.4 抗癌Ⅰ号方对P-gp蛋白表达的影响

为了评估抗癌Ⅰ号方对P-gp表达的影响，我们采用Western blot进行分析。结果(图4)显示，与BEL7402细胞相比，在BEL7402/5-Fu细胞中检测到P-gp的高表达；然而，在用抗癌Ⅰ号方含药血清处理48 h后，P-gp表达显着降低。

图4肝癌细胞内P-gp蛋白表达水平

3 讨论

目前，肝癌患者的治疗选择包括手术切除，肝移植，分子靶向治疗和化疗[6]。对于单个肿瘤直径<5 cm的局部肝癌，根治性手术切除仍然是首选并且最有效的方法[7]。肝移植被认为是治疗终末期肝病或原发性肝癌患者的有效方法，但预防移植后肝癌复发和提高患者生存率仍然是一个挑战[8]。近年来，针对表皮生长因子受体，血管内皮生长因子和多种氨基酸激酶的小分子靶向药物已逐渐应用于肝癌患者的临床治疗。然而，这些药物价格昂贵且未广泛使用[9]。因此，化疗对于晚期肝癌患者仍然至关重要。通常用于肝癌治疗的化学治疗药物包括5-Fu及其衍生物，铂类(如顺铂，奥沙利铂)和蒽环霉素(如阿霉素和多柔比星)[10]。虽然奥沙利铂，5-Fu和多柔比星的联合用药被广泛用于治疗晚期原发性肝癌，并且疗效可靠，耐受性好，然而其化学抗性仍然是限制其应用的一个持久难题[11]。

中药作为防治肿瘤的重要组成部分，在辅助化疗药物增强功效、减轻副作用、降低耐药性方面具有其独特的优势[12-13]。抗癌Ⅰ号方为广州中医药大学顺德医院治疗癌症的经验方，灵芝、铁皮石斛、白花蛇舌草、藤梨根和蜂蜜组成。方中灵芝滋补脾肾、提高免疫力；铁皮石斛益胃生津、滋阴清热；白花蛇舌草、藤梨根清热解毒，诸药相合，具有益气养阴、化瘀解毒的功效。临床上初步发现该方对肝癌患者增强机体免疫功能、与化疗合用协同增效及改善提高生存质量等多方面有一定的作用。现代药理学研究表明灵芝中有效成分灵芝多糖能够抑制HepG2肝癌细胞体内外增殖[14]，铁皮石斛的有效成分石斛多糖能够抑制HepG2、Hela、MCF-7等多种肿瘤细胞增殖[15]，白花蛇舌草、藤梨根能够抑制多种肿瘤的生长[16-17]。本研究发现抗癌Ⅰ号方能够抑制耐药肝癌细胞活力，表明抗癌Ⅰ号方能部分逆转耐药肝癌细胞的耐药性。

现代研究表明药物外排是MDR发展的关键机制[18]。P-gp也被称为多药耐药蛋白1(MDR1)，是细胞膜中的重要蛋白质，可作为外排泵将药物从细胞内排出至细胞外基质[19]。P-gp负责减弱细胞内药物积累和介导MDR。在本研究中，我们检测了BEL-7402/5-Fu和BEL-7402细胞中P-gp的表达，发现BEL-7402/5-Fu细胞中P-gp的表达高于BEL-7402细胞。而抗癌Ⅰ号方通过阻断MDR1 基因转录显着抑制P-gp的表达。罗丹明123是P-gp底物和荧光染料。细胞中罗丹明123的累积通常反映P-gp转运能力，通常作为P-gp功能的指标[20]。我们观察了抗癌Ⅰ号方对P-gp介导的药物外排的影响发现，抗癌Ⅰ号方处理后罗丹明123的荧光强度增加，表明抗癌Ⅰ号方可以增加抗癌药物的积累，从而逆转肝癌细胞的耐药性。

综上所述，抗癌Ⅰ号方能够通过下调肝癌细胞中P-gp减轻化疗药物外排，逆转肝癌细胞的耐药性，发挥抗肝癌作用。