干旱胁迫对马尾松菌根化苗木水分生理和光合特性的影响

王 艺，张 弛，丁贵杰，黎之骞

（1.贵州民族大学 生态环境工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 林学院，贵州 贵阳 550025）

马尾松Pinus massoniana是我国南方地区针叶树种中面积最大、分布最广、综合利用程度最高的乡土树种[1]，是典型的先锋树种和外生菌根树种[2]。外生菌根是土壤中的外生菌根真菌与植物根系形成的一种互惠共生结构，它可以通过外延菌丝扩大植物根系的吸收面积，改善土壤中矿质元素的形态，增强植物对营养和水分的摄取能力，提升植物的抗旱能力[3]。近年来，一些研究者相继报道了菌根对植物生长形态[4-5]、养分吸收[6]、水分状况[7-8]及光合特性[9-10]影响的研究，但多集中于内生菌根[11-12]，对于外生菌根的研究较少[13-14]，特别是对于干旱胁迫下外生菌根对苗木水分生理和光合特性的影响报道更少[15-16]。

干旱是限制林木生长发育的重要逆境因子，它影响种子萌发，降低幼苗存活率[17-18]。贵州省虽属亚热带湿润季风气候，降雨量充沛，但许多地区土层浅薄，山体渗漏性强，容易发生阶段性干旱。因此，利用菌根植物抗旱特性，以先锋树种马尾松作为外生菌根模式植物，研究外生菌根对植物抗旱性的影响，对解决地表侵蚀严重地区的生态恢复和促进林木生长具有重要现实指导意义。

1 材料及方法

1.1 试验材料

在前期研究基础上，选取5 株对马尾松促生效果较好的外生菌根真菌为供试菌株，分别是褐环乳牛肝菌Suillus luteusSL7&SL1，简称S7 和S1，采集于重庆金佛山；鸡油菌Cantharellus cibarius，简称G，和彩色豆马勃Pisolithus tinctoriusStrain Pt 715，简称C，均采自四川西昌桉树林下；土生空团菌Cenococcum geophilumStrain Cg SIV，简称T，从西班牙欧洲火炬松林下土壤分离。菌种由西南大学黄建国教授所提供，对照（CK）为不接菌。马尾松种子于2010 年2 月采自贵州省都匀市马鞍山林场优良母树林，储藏后备用，所用苗木在大棚内自育。采用Pachlewski 固、液培养基[19]。

1.2 试验方法

1.2.1 种子及土壤处理 2010 年3 月选择籽粒饱满的马尾松种子，75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗5 次，在初始温度40℃温水中浸泡24 h，取出用湿纱布包裹，置于25℃恒温箱催芽，种子裂嘴露白时可播种。试验基质采用黄壤与河砂混合，体积比9：2，高压灭菌锅（压力0.14 Mpa,124～ 126℃）2 h 连续灭菌。塑料花盆规格250 mm×280 mm，95%的酒精消毒。供试土壤基本性质见表1。

表1 供试土壤基本化学性质Table 1 Basic chemical properties of soil used in the experimental

1.2.2 播种和接种 在苗床上均匀喷洒液体菌剂800 mL·m-2，然后将催芽的种子条播于苗床上（1.6 g·m-2），最后再将100 mL 菌剂喷洒于种子周围，覆土。CK 以同样方式加等量无菌培养液。试验在苗圃大棚内进行，夏季平均相对湿度78%，平均温度27℃。各菌种处理间用隔板间隔约30 cm 避免交叉污染。当苗木达1 年生时，选择生长一致的苗木移栽至盆内，正常生长后（一个星期），进行干旱胁迫试验。

1.2.3 试验设计 试验采用双因素随机区组设计，因素A 为接种处理（播种时进行）：分别接种S7，G，S1，C，T 和CK；因素B 为4 个水分梯度处理，通过称质量补水法控制土壤相对含水量为：正常水分（65±5）%、轻度胁迫（50±5）%、中度胁迫（35±5）%和重度胁迫（25±5）%（以下简称正常、轻度、中度和重度）。每处理10 盆，每盆3 株，重复3 次，干旱胁迫2 个月后进行相关指标测定。

1.3 指标测定

待苗木半年生时，各接种处理随机抽40 株苗进行侵染率检测[20]，发现菌根化苗木侵染率均达100%，而未接种苗木侵染率为0。胁迫试验结束后，取苗测定叶片相对含水量RWC、水分饱和亏缺WSD、叶片水势LWP、自由水含量、束缚水含量和叶绿素等生理指标[21-22]。用Li-6400 便携式光合作用仪（Li-Cor，Lincoln，Nebraska，USA）在晴朗天气的8：00-18：00 之间测定各光合参数指标。每处理取样3 株，自上而下选择第3 至第4 叶序处的功能叶一片，重复3 次。根据测定结果计算光合耗水量、气孔限制值Ls[23]、水分利用效率WUE[24]、光能利用效率LUE[25]和CO2利用效率CUE[26]。

光合耗水量为蒸腾速率Tr与净光合速率Pn的比值。

式中，Ls为气孔限制值，Ca和Ci分别为空气和胞间CO2浓度。

式中，E为蒸腾速率。

式中，PAR为光合有效辐。

1.4 数据处理

采用SAS（Release6.03）统计软件[27]对数据进行方差分析、Duncan 多重比较及主成分分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对菌根化马尾松苗水分生理的影响

2.1.1 外生菌根真菌对苗木叶片相对含水量RWC和水分饱和亏WSD的影响 由图1 可知，外生菌根真菌提高了苗木的RWC，降低了WSD，与CK 间差异显著（P＜0.05）。随着干旱胁迫的增加，CK 苗木的RWC逐渐降低，WSD逐渐增加。而菌根化苗木则变化不一，其中接种S1 和C 的苗木RWC随干旱胁迫的加剧逐渐增加，分别比各自在正常水分条件下RWC含量增加9.2%和3.5%；而接种S1 和T 的苗木WSD随干旱胁迫的加剧逐渐减低，分别比各自在正常水分条件下WSD含量降低9.3%和4.9%。相同水分下，菌根化苗木RWC均显著高于CK（P＜0.05），而WSD则显著低于CK。轻度、中度和重度胁迫时，接种S1 的苗木RWC含量最高，分别比CK增加了76.8%，154%和185%，而WSD含量最低，分别比CK 下降了40.0%，41.0%和45.6%。

图1 干旱胁迫对苗木叶片相对含水量和水分饱和亏缺的影响Figure 1 Effect of water stress on relative water content and water saturation deficit in leaf of seedlings

2.1.2 外生菌根真菌对马尾松苗木水势LWP的影响 由图2 可见，随干旱胁迫的增加，菌根化苗木LWP先增后降，均在中度胁迫时达最大，与各自在正常水分条件下相比，LWP增幅大小依次是：C（194%）＞G（175%）＞S7（134%）＞T（128%）＞S1（126%）；而CK 的随水分降低逐渐增加。相同水分下，菌根化苗木LWP均低于CK，其中以接种S1 的苗木LWP最低，4 种干旱胁迫梯度相应地比CK 降低了：38%（正常），33%（轻度），39%（中度）和46%（重度），说明接种外生菌根真菌能降低苗木LWP，而干旱胁迫对苗木LWP有一定影响，中度胁迫后，菌根化苗木LWP开始逐渐降低，与外界形成水势梯度，利于根系吸收水分，这是苗木对干旱的适应性反应。

图2 水分胁迫对苗木叶片水势的影响Figure 2 Effect of water stress on leaf water potential in seedlings

2.1.3 外生菌根真菌对苗木自由水和束缚水的影响 由图3 可知，随干旱胁迫的加剧，接种S7，S1 和T 的苗木自由水含量先降后增，在中度胁迫时最低，与各自在正常水分条件下相比，自由水降幅为：S7（38%）＞S1（27%）＞T（26%）；接种G，C 和CK 苗木则逐渐降低，重度胁迫时最低。对于苗木束缚水含量，接种S7，S1，T 和CK 苗木先增后降，在中度胁迫时达最大，与各自在正常水分条件下相比，束缚水增幅为：T（173%）＞S1（116%）＞S7（96%）＞CK（43%）。而接种G 和C的苗木逐渐增加，与各自在正常水分条件下相比，束缚水增幅为：50%和76%。

轻度胁迫时，接种S7 的苗木自由水含量最高，比CK 增加248%；中度和重度胁迫时，接种S1 的苗木自由水含量最高，分别比CK 提高151%和252%，差异显著（P＜0.05）。苗木束缚水含量，在轻度、中度和重度胁迫时，以接种S1 的含量最高，分别比CK 提高63%，157%和98%，差异显著（P＜0.05）。

可见，干旱胁迫下苗木主要通过降低体内自由水含量，增加束缚水含量，增强保水力，提高自身抗旱能力。而外生菌根能显著改善苗木水分状况，即使在干旱胁迫下菌根化苗木仍能表现出明显效果。

图3 干旱胁迫对苗木自由水和束缚水含量的影响Figure 3 Effect of water stress on free water and bound water content in leaf of seedlings

2.2 干旱胁迫对菌根化马尾松幼苗光合指标的影响

2.2.1 外生菌根真菌对苗木叶绿素的影响 不管是在正常水分条件下，还是在相同的干旱胁迫条件下（表2），各菌根化苗木叶绿素含量均高于CK，说明外生菌根提高了苗木叶绿素含量。随着干旱胁迫加剧，苗木叶绿素含量逐渐下降，其中CK 降幅最大，高达28.6%，可见CK 比菌根化苗木受到干旱伤害更大，从另一方面也说明外生菌根真菌能减少干旱胁迫对马尾松幼苗的伤害。

2.2.2 外生菌根真菌对马尾松苗木光合特性的影响 多重比较结果表明（表3），随着干旱胁迫加剧，苗木Pn，Gs的变化趋势相同，均呈先增后减，中度胁迫时最大，其中接种S1 的苗木效果最好，Pn和Gs比在正常水分条件下分别增加48.6%和34.4%；而Ls和光合耗水量均在轻度胁迫时最低，菌种S1 的作用最明显。干旱胁迫初期，菌根化苗木以降低Tr，减少水分消耗的方式适应干旱环境。Ci的变化则与苗木Tr的变化趋势相反。

表2 干旱胁迫对马尾松幼苗叶绿素含量的影响Table 2 Effect of water stress on chlorophyll content in leaf of seedlings

表3 干旱胁迫对外生菌根真菌对马尾松幼苗光合特性的影响Table 3 Effect of water stress on photosynthetic properties in different treated seedlings

相同水分下，菌根化苗木间Pn，Ci，Ls和光合耗水量等指标差异显著（P＜0.05）。外生菌根真菌能显著提高苗木Pn，各水分条件下，均以接种S1 的苗木Pn最大；菌根化苗木Tr低于CK（重度胁迫时除S7 和T）。菌根化苗木Gs均高于CK，轻度和中度胁迫下，以接种S1 的苗木Gs最大，分别比CK 增加了54.9%和63.6%，但差异不显著（P＞0.05）。外生菌根真菌能显著提高苗木Ci，菌种S1 作用最明显。菌根化苗木Ls均小于CK，两者差异显著（P＜0.05）。从菌根真菌对试验苗木光合耗水量影响看，接种能有效减少马尾松苗木的光合耗水量，接种与非接种苗之间差异显著（P＜0.05），其中菌株S1 作用最明显。

2.2.3 外生菌根真菌对马尾松苗木光合资源利用效率的影响 随干旱胁迫加剧，CO2，水分和光能3 种资源利用效率均呈先增后降趋势，WUE轻度胁迫时最大，而LUE和CUE在中度胁迫时最大，说明干旱胁迫对资源利用效率影响不同。外生菌根真菌能有效提高苗木光合资源利用效率，与CK 间差异显著（P＜0.05，表4）。轻度胁迫时，接种S1 的苗木WUE最高，较CK 增加212%；中度胁迫时，S1 的LUE 最高，T 的CUE最高，分别比CK 增加了62%和45%。

由资源利用效率的计算公式可知，3 种资源利用效率均与光合速率成正比，外生菌根真菌能显著提高苗木Pn，降低苗木Tr，Ls和光合耗水量，因此，外生真菌能显著提高资源利用效率，对苗木生长起着积极的促进作用。

表4 干旱胁迫下外生菌根真菌对马尾松苗木资源利用效率的影响Table 4 Effect of water stress on efficiency of resource utilization in different treated seedlings

2.3 干旱胁迫下菌根化马尾松苗木抗旱指标的主成分分析

选取Pn，Tr，Gs，Ci，Ls，光合耗氧量，叶绿素，WUE，LUE，CUE，RWC，WSD，自由水含量（编号X1～ X13）13 项指标，对菌根化苗木的抗旱性进行了综合评价。计算结果表明（表5），前3 个主成分的累积贡献率达86.167%。第一主成分贡献率为49.35%，载荷较高且符号为正的有Pn，LUE，Gs，CUE等，故称光合利用效率因子；第二主成分贡献率为27.56%，载荷较高的有Ls，Tr，光合耗水量，故称气孔限制因子；第三主成分贡献率为9.26%，载荷较高的有自由水，RWC，WUE等，故称水分因子。

根据因子得分系数，计算出6 种菌根接种处理苗木单因子的得分值F1，F2，F3 和综合得分值F（表6），抗旱性由强到弱顺序为：S1＞T＞S7＞G＞C＞CK，说明接种S1 的苗木抗旱能力最强。

表6 菌根化幼苗单因子综合得分及排序Table 6 The top six factors of treated seedlings

3 结论与讨论

3.1 干旱胁迫下外生菌根真菌改变了马尾松苗木水分代谢，提高了水分利用效率

以往认为菌根主要是通过扩大菌丝网，来扩大根系吸收面积，降低土壤与植物之间的液流阻力（Rs-p）[28]，增强根系对水分吸收能力；同时菌套还能防止根系水分丧失，改善植物水分状况，尤其在土壤干旱条件下更为明显[29]。前期研究除证明上述观点外，还从生理角度，进一步揭示外生菌根能增加植物抗旱生理，使菌根化苗木各项生理指标产生明显变化[30-31]，而本研究发现，这种变化直接改变了马尾松菌根苗水分生理，使苗木含水量增加，水势和水分饱和亏缺降低，从而增强保水力，使苗木只轻微感受到干旱胁迫，且能继续正常生长发育，可见干旱对菌根苗的影响不大，其中菌种S1 表现最好。

3.2 干旱胁迫下外生菌根真菌增强了马尾松苗木光合特性，提高了资源利用效率

干旱胁迫对光合特性的影响过程是极其复杂的。Caravaca 等[32]报道干旱胁迫下接种G.intraradices提高了木犀榄Olea europaea植株的光合速率、蒸腾速率和气孔导度。高悦等[15]报道外生菌根真菌能明显提高马尾松、湿地松Pinus elliottii和黑松P.thunbergii菌根苗针叶中的叶绿素含量。宋微等[16]报道菌根真菌接种对杨属Populus树种叶绿素、净光合速率、蒸腾速率和气孔导度均起积极促进作用。本试验结果表明，无论在正常还是干旱胁迫下，外生菌根真菌均能显著提高马尾松苗木的叶绿素，Pn，Gs和资源利用效率。较高的Pn使菌根化苗木Gs增强，资源利用效率提高，气孔对水分的阻力减小，Ls降低，从而提高菌根化苗木对水分的吸收。此结果进一步印证了李志辉等[33]提出的光合速率对气孔导度具有反馈调节作用，即在有利于叶肉细胞光合时，气孔导度增大，而不利于光合时，气孔导度减小。光合速率的下降分为气孔限制和非气孔限制两类，如果气孔限制是导致光合速率下降的主要因素，那么光合速率的下降伴随气孔导度降低；如果光合速率的下降主要是由于非气孔限制造成的，光合速率下降的同时将伴随气孔导度的上升。从本试验结果看，轻度干旱胁迫后，虽然Gs与Pn随土壤含水量降低而变化方向一致，但Pn与Ci浓度变化方向相反，可认为非气孔限制是干旱胁迫苗木净光合速率降低的主要原因，且非菌根化苗木比菌根化苗木受到干旱胁迫的伤害更大。

外生菌根真菌降低了苗木Tr，但处理间差异不显著（P＞0.05）。Tr的降低可认为是马尾松苗木适应干旱环境的一种表现。由此可见，马尾松苗木主要通过增加Pn降低Tr和光合耗水量来提高水分利用效率，刘现刚等[34]在研究栓皮栎Quercus variabilis苗木抗旱性时也得出类似结论。

3.3 明确了干旱胁迫下各菌种抗旱能力的强弱

干旱胁迫下各菌根化苗木抗旱指标的主成分分析结果表明，马尾松菌根化苗木主要通过增加光合利用效率，降低蒸腾失水，提高苗木水分含量，增强苗木抗旱性。对各菌根化苗木在干旱胁迫下的抗旱性强弱进行了排序，其抗旱能力由强到弱为：S1＞T＞S7＞G＞C＞CK。